抗敏止嗽颗粒对哮喘小鼠PI3K/Akt通路和Th1/Th2的调控作用研究

崔建茹,孙美好,王蓓蕾,2,周庆伟,2

(1.河南中医药大学,河南 郑州 450046;2. 河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000)

哮喘是一种异质性慢性疾病,主要病理特征为气道炎症、可逆性气道阻塞和气道重塑,病程缠绵,严重影响患者的生活质量,甚至会危及生命[1-2]。现代医学主要采用支气管扩张剂、糖皮质激素治疗哮喘,可控制哮喘发作,但长期用药有明显不良反应,影响患者用药依从性[3]。中医中药治疗有“标本兼治”的特点,在哮喘等慢性疾病的治疗中有着一定的优势[4-5]。抗敏止嗽颗粒是周庆伟教授在止嗽散的基础上进行加减用于治疗发作性哮喘的经验方,临床证实该方药可减轻气道炎症,降低气道高反应性[6],但其具体的作用机制尚不清楚。目前研究表明,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt) 信号通路的激活和Th1/Th2的失衡介导了哮喘气道炎症、气道重塑等病理过程,进而加重哮喘,抑制该通路活化和调节Th1/Th2平衡可有效控制哮喘发作[7-8]。故本实验通过观察抗敏止嗽颗粒对哮喘小鼠PI3K/Akt信号通路及Th1/Th2平衡的影响,探讨了其作用机制,旨在为临床应用提供客观依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性BALB/c小鼠48只,6～8周龄,体重(20±2)g,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(浙)2019-0001。小鼠饲养于河南中医药大学第一附属医院中心实验室,饲养环境为温度(24±1)℃,湿度(50±15)%,12 h明暗交替,自由进食饮水。本实验经河南中医药大学伦理委员会批准(YFYDW2020001)。

1.2药品 抗敏止嗽颗粒,由炙麻黄10 g、炒紫苏子15 g、紫苏叶15 g、蜜紫菀15 g、蜜款冬花15 g、蜜枇杷叶15 g、防风15 g、醋五味子15 g、乌梅20 g、地龙20 g、僵蚕20 g、蝉蜕20 g组成,配方颗粒剂由河南中医药大学第一附属医院中药房提供。地塞米松片,新乡市常乐制药有限公司,国药准字H41020216,规格:0.75 mg/片。

1.3主要试剂及仪器 卵清白蛋白(OVA, Sigma,批号:SLCB8249),氢氧化铝凝胶(Thermo,批号:VG304133),HE染色剂(批号:G1005)、Masson染色剂(批号:G1006)、RNA提取液(批号:G3013)、BCA试剂盒(批号:G2026)、β-actin(批号:GB12001)、PI3K抗体(批号:GB13471)、Akt抗体(批号:GB13427)、GAPDH(批号:GB11002)、白细胞介素-4(IL-4,批号:220419M)、干扰素-γ(IFN-γ,批号:220419M)均购自Servicebio公司。雾化器(成都维信,型号:CW2605C1 ),荧光定量PCR仪(Bio-rad,型号:CFX),超微量分光光度计(Thermo,型号:NanaDrop2000),酶标仪(Rayto,型号:RT-6100),台式高速冷冻离心机(DRAGONLAB,型号:D3024R)。

1.4实验方法 将48只小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、抗敏止嗽颗粒低剂量组、抗敏止嗽颗粒中剂量组、抗敏止嗽颗粒高剂量组和地塞米松组,每组8只。除空白组外,其余组小鼠分别于第1天、第7天腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(含 OVA 2.5 mg、氢氧化铝100 mg、PBS 10 mL);实验第15天开始,各造模组小鼠给予0.1%OVA雾化吸入30 min激发哮喘,1次/d,连续7 d。于实验第15～21天雾化激发前1 h,抗敏止嗽颗粒低、中、高剂量组分别给予0.35 g/kg、0.7 g/kg、1.4 g/kg抗敏止嗽颗粒灌胃,地塞米松组给予地塞米松0.075 mg/kg灌胃,空白组和模型组给予蒸馏水灌胃。在实验末次雾化激发24 h后进行取材。

1.5检测指标及方法

1.5.1血清炎症因子水平 各组小鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉后,摘眼球取血,于4 ℃下3 000 r/min离心15 min,取血清放置于-20 ℃冻存。按ELISA试剂盒说明书检测IL-4、IFN-γ水平,计算IFN-γ/IL-4比值。

1.5.2肺组织病理形态 摘取各组小鼠肺组织,用4%多聚甲醛固定右肺中叶48 h,之后进行脱水包埋,切成5 μm厚薄片备用,苏木素染色和0.5%伊红染色,中性树胶封片,晾干,置于光学显微镜下观察肺组织病理形态。将切片脱蜡至水,Masson染液浸染,1%盐酸酒精分化,切片用1%冰醋酸漂洗分化,无水乙醇脱水,中性树胶封片,显微镜镜检和图像采集分析。

1.5.3肺组织中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达情况 采用Western blot技术检测:取0.1～0.2 g小鼠肺组织样本,每100 mg样本加入1 mL体积的RIPA裂解液,用匀浆器在冰上充分研磨匀浆,在4 ℃下裂解0.5 h, 超声破碎仪破碎,4 ℃、12 000 r/min离心10 min, 取上清液,用BCA试剂盒测定肺组织蛋白浓度,之后采用5%SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离,转膜、封闭,一抗孵育过夜后,二抗室温下孵育30 min,之后洗涤条带,加入ECL发光液进行曝光显影,成像分析仪自动成像,Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.5.4肺组织中PI3K、Akt mRNA表达情况 采用荧光定量PCR技术检测:取小鼠肺组织100 mg,TRIzol试剂从肺组织中提取总RNA,将总RNA浓度稀释为100 μg/mL,使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,将cDNA在荧光定量PCR系统中进行扩增反应。PCR条件:90 ℃ 10 min预变性;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40个循环;65～95 ℃每升温0.5 ℃采集1次荧光信号。最终数据按照ΔΔCT法进行处理分析。内参基因和目的基因的引物序列见表1。

表1 内参基因和目的基因的引物序列

2 结 果

2.1各组小鼠血清IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比较 与空白组比较,模型组血清IL-4水平明显升高(P<0.05),血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,抗敏止嗽颗粒各组和地塞米松组血清IL-4水平均明显降低(P均<0.05),血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4均明显升高(P均<0.05);与抗敏止嗽颗粒低剂量组比较,抗敏止嗽颗粒高剂量组和地塞米松组血清IL-4水平均更低(P均<0.05),血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4均明显更高(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和哮喘各组小鼠血清IL-4、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比较

2.2各组小鼠肺组织HE染色表现 空白组小鼠肺组织结构正常;模型组小鼠肺组织可见大量炎性细胞浸润,肺泡壁大面积中度增厚,肺泡间隔增宽;与模型组组比较,抗敏止嗽颗粒各组及地塞米松组小鼠炎性细胞浸润、肺泡壁增厚和肺泡间隔增宽有不同程度的改善,其中抗敏止嗽颗粒高剂量组和地塞米松组改善更明显。见图1。

图1 空白组和哮喘各组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

2.3各组小鼠肺组织Masson染色表现 空白组小鼠肺组织中仅有少量淡蓝色胶原纤维沉积;模型组小鼠可见上皮细胞紊乱、脱落,气道壁增厚,管腔狭窄,部分小血管形成和大量的胶原纤维沉积;抗敏止嗽颗粒各组及地塞米松组小鼠气道壁增厚、管腔狭窄、小血管形成和胶原沉积情况较模型组明显改善;抗敏止嗽颗粒高剂量组改善情况优于抗敏止嗽颗粒低剂量组,但差于地塞米松组。见图2。

图2 空白组和哮喘各组小鼠肺组织Masson染色表现(×200)

2.4各组小鼠肺组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达情况 模型组 p-Akt、p-PI3K蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);抗敏止嗽颗粒各组及地塞米松组p-Akt、p-PI3K蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),且抗敏止嗽颗粒高剂量组和地塞米松组均明显低于抗敏止嗽颗粒低剂量组(P均<0.05)。见图3及表3。

图3 空白组和哮喘各组小鼠肺组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达情况

表3 空白组和哮喘各组小鼠肺组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量比较

2.5各组小鼠肺组织中PI3K、Akt mRNA表达情况模型组PI3K、Akt mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);抗敏止嗽颗粒各组及地塞米松组PI3K、Akt mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),且抗敏止嗽颗粒高剂量组PI3K mRNA相对表达量明显低于抗敏止嗽颗粒低剂量组(P<0.05),抗敏止嗽颗粒高剂量组Akt mRNA相对表达量明显高于抗敏止嗽颗粒低剂量组(P均<0.05)。见表4。

表4 空白组和哮喘各组小鼠肺组织中PI3K、Akt mRNA相对表达量比较

3 讨 论

支气管哮喘患者多表现为咳嗽阵发、咽痒即咳、气急,遇到冷空气、刺激性气味常咳嗽突发或加重,且多为干咳或少痰,与中医“风胜则动”的观点相符合。故周庆伟教授从“风”论治支气管哮喘,认为“风邪伏肺”为其根本病因,“痰、饮、瘀”为风邪引动的病理产物,基于此创“抗敏止嗽颗粒”治疗支气管哮喘发作期。方中炙麻黄、苏叶、苏子、防风疏风宣肺,升阳散邪;炙枇杷叶、蜜款冬花、蜜紫菀化痰止咳,清肺降气;因伏痰胶结,宜虫药入络搜邪[9],故以僵蚕、蝉蜕、地龙熄风通络止痉;风邪化燥久恋伤阴,以五味子、乌梅生津润肺、敛肺定喘;诸药合用,散风祛痰而不耗气伤津,敛肺降气而不留邪于内,共奏祛风解痉、宣肺化痰之功效。

Th1/Th2失衡在哮喘发生发展中的作用是近年来的研究热点。IL-4是Th2细胞的特征性细胞因子,哮喘发生时其可以刺激B细胞产生IgE抗体以及促进嗜酸性粒细胞增多,从而使肥大细胞释放组胺、白三烯等,诱发气道炎症[10]。IFN-γ是Th1细胞的特征性细胞因子,与IL-4相互拮抗[11]。哮喘发生时,患者体内的Th1/Th2细胞因子偏移,IFN-γ分泌受到抑制,从而引起Th2的过度免疫,加重气道炎症[12]。本实验结果显示,模型组小鼠血清IL-4水平明显升高,血清IFN-γ水平明显降低,肺部组织炎症浸润明显,说明哮喘小鼠存在Th1/Th2 比例失衡,引发炎症反应;抗敏止嗽颗粒各组血清IL-4水平明显降低,血清IFN-γ水平明显升高,肺组织炎症浸润明显减轻,说明抗敏止嗽颗粒可调节Th1/Th2趋于平衡,从而减轻气道炎症。

PI3K/Akt信号通路与哮喘有着密切的关系[13]。PI3K/Akt信号通路及其下游信号因子可以通过促进Th2细胞的活化[14],调节自噬[15],参与调控核因子-κB[16]等机制,影响哮喘的发病。当PI3K/Akt信号通路激活时,可以促进Th2细胞因子的释放,诱发哮喘的气道炎症反应,引起气道高反应性[17]。而抑制PI3K/Akt信号通路可以减少肺组织中炎性细胞浸润,减少胶原沉积,减轻气道重塑[18-21]。因此抑制PI3K/Akt信号通路可能是治疗呼吸系统炎症性疾病如哮喘的新疗法。本实验结果显示,模型组小鼠肺组织中可见胶原纤维沉积,肺组织中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量和PI3K、Akt mRNA相对表达量均明显升高,提示哮喘小鼠PI3K/Akt信号通路被激活;抗敏止嗽颗粒各组肺组织中胶原纤维沉积减少,肺组织中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量和PI3K、Akt mRNA相对表达量均明显降低,表明抗敏止嗽颗粒可通过抑制PI3K/Akt信号通路而减少胶原沉积,发挥治疗哮喘的作用。

综上所述,抗敏止嗽颗粒可以有效调节Th1/Th2比例失衡,增强Th1、抑制Th2的免疫应答,从而减轻过敏性哮喘小鼠的炎症反应和气道重塑,其具体机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路相关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。