香芹酚对心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响研究

夏 杨,董 晖

(武警北京总队医院,北京 100027)

《中国心血管健康与疾病报告》调查显示,中国城乡居民死亡的首要原因依然是心脑血管疾病,尤其是心肌梗死[1]。及时疏通血管,对缺血心肌进行再灌注是治疗心肌梗死的有效手段,但会引发心肌再次受损,如何缓解心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是当下心血管领域重点关注的问题。香芹酚即5-异丙基-2-甲基苯酚,为唇形科植物提取出的单萜酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗病原微生物、抗肿瘤、保护血管、保护肝脏等多种药理效应[2]。近年来国内外学者研究发现香芹酚可能通过降低氧化应激水平、抑制细胞凋亡、增强细胞自噬等多种途径保护再灌注受损的心肌组织[3-7],但其具体机制仍不明确。本实验从线粒体凋亡途径入手,通过构建MIRI大鼠模型,探讨香芹酚预处理的心肌保护作用及其相关机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 SD大鼠48只,雌雄各半,体重(200 ± 20)g,由北京安凯毅博生物技术有限公司提供,生产许可证号:SCXK(京)2017-0006。饲于动物房屏蔽环境,温度20～23 ℃,相对湿度60%～70%,明暗光照12 h∶12 h。所有动物相关操作规程均经武警北京总队医院动物伦理委员会批准认可。

1.2药品和试剂 香芹酚(纯度99%),美国Sigma-Aldrich公司产品,临用前以1%二甲基亚砜(DMSO)配成浓度1%、0.5%的溶液作为高、低剂量。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、碘化丙啶(PI),美国Amresco公司产品。线粒体细胞色素C(Cyt C)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,美国R&D Systems公司产品。半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)活性检测试剂盒(荧光法),美国Clontech公司产品。Trizol试剂、反转录试剂盒及实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒,美国Applied Biosystems公司产品。B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及内参β-actin等引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。

1.3仪器设备 ECG-2360型十二导联心电图机,上海光电医用电子仪器有限公司产品;DHX-500型动物人工呼吸机,北京金洋万达科技有限公司产品;PT2500E型高速匀浆仪,瑞士Kinematica公司产品;CKX41型光学显微镜,日本Olympus公司产品;医学图像分析系统,北京环中睿驰科技公司产品;FACS101型流式细胞仪,美国Becton Dickinson公司产品;SpectraMax iD3型荧光酶标仪,美国Molecular Devices公司产品;Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,美国Agilent 公司产品。

1.4实验方法 将大鼠随机分为假手术组、模型组、香芹酚低剂量组、香芹酚高剂量组,每组12只。于造模术前1周开始,香芹酚低、高剂量组分别给予香芹酚溶液50 mg/kg和100 mg/kg腹腔注射,假手术组和模型组给予等体积1%二甲基亚砜腹腔注射,均1次/d,术前30 min再给药1次。模型组和香芹酚低、高剂量组采用冠脉左前降支结扎术[8]构建MIRI模型:麻醉后的大鼠仰位固定于手术台,连接动物呼吸机并监测心电图;于胸骨左旁第3～4肋间开胸,剪开心包膜,暴露心脏,在左心耳下缘2 mm处进针,肺动脉圆锥旁出针,进针深度约1 mm,将6/0缝线与充气球囊一同结扎左冠脉前降支,关胸;球囊充气后,心电图ST段呈明显弓背抬高作为缺血成功的标志,持续45 min;抽空球囊,再灌注6 h,心电图抬高的ST段下降50%以上作为再灌注成功的标志。假手术组大鼠开胸后只冠脉穿线但不结扎,其余操作同上。

1.5观察指标及方法

1.5.1NBT染色法测定心肌梗死面积 再灌注结束后,每组随机取6只大鼠,处死后剪取心脏,洗净,去除心房及右室,置于-20 ℃冰冻30 min,沿长轴切成厚度约2 mm的薄片5片,浸于0.1% NBT溶液中,37 ℃下孵育30 min,并以10%福尔马林固定24 h,正常心肌呈蓝色,缺血未梗死心肌呈浅红色,梗死心肌呈灰白色。显微镜下成像,导入图像分析系统,测算梗死区面积(IA)、危险区面积(AAR)和心室总面积(LVA),计算IA/AAR、IA/LVA以评估心肌梗死情况。

1.5.2流式细胞术测定细胞凋亡率 每组取剩余6只大鼠,处死后剪取心脏,洗净,于冠脉结扎线下方取部分心肌组织,剪碎后加PBS缓冲液充分研磨,收集细胞悬液,1 000 r/min低温离心5 min,弃上清,用PBS缓冲液洗涤数次并重悬,获得较纯的心肌细胞,于光镜下进行细胞计数,调整心肌细胞浓度约为1×106个/mL;将心肌细胞重悬于70%预冷的乙醇中低温固定过夜,检测前1 000 r/min低温离心,用PBS缓冲液洗去乙醇,细胞沉淀用PI低温避光染色30 min,上流式细胞仪检测。

1.5.3ELISA法测定胞浆中Cyt C含量 取上述浓度约1×106个/mL的心肌细胞,重悬于预冷的裂解缓冲液中,冰浴5 min,10 000 r/min低温离心5 min,收集上清(胞浆抽提物)。取已包被Cyt C单克隆抗体的96孔板,加入胞浆样品与链霉亲和素-辣根过氧化物酶耦联抗体,按试剂盒说明书操作,上酶标仪测定450 nm吸光度(OD)值,并计算样品浓度。

1.5.4荧光法测定胞浆中Caspase-3和Caspase-9活性 取上述胞浆抽提物,植于96孔板,按试剂盒说明书加入反应试剂和荧光底物,阴性对照孔中加入Caspase抑制剂,37 ℃下避光孵育1 h,上荧光酶标仪(激发光波长400 nm,发射光波长505 nm)检测,以荧光强度表示Caspase-3、Caspase-9活性。

1.5.5RT-qPCR法测定心肌组织中Bcl-2、Bax mRNA表达情况 每组于冠脉结扎线下方取部分心肌组织,冻存于-80 ℃液氮中;检测前精密称重,研磨成粉,经Trizol试剂法提取总RNA,后反转录为cDNA,继而行RT-qPCR扩增(引物片段长度149～163 bp),获取样本基因Ct值后,以β-actin为内参照进行均一化处理,采用公式2- Ct计算样本基因的相对表达量。Bcl-2上游引物序列为 5’-GTCACAGAGGGGCTACGA-3’,下游引物序列为5’-GTCCGGTTGCTCTCAGG -3’;Bax上游引物序列为5’-CGGCTGCTTGTCTGGAT-3’,下游引物序列为5’-TGGTGAGTGAGGCAGTGAG-3’;β-actin上游引物序列为5’-GTTGTGGCTCTGACATGCT-3’,下游引物序列为5’-CCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。

2 结 果

2.1各组心肌梗死面积比较 香芹酚低、高剂量组IA/AAR、IA/LVA均明显低于模型组(P均<0.05),香芹酚低、高剂量组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 假手术组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌梗死面积比较

2.2各组心肌细胞凋亡率比较 假手术组、模型组、香芹酚低剂量组、香芹酚高剂量组细胞凋亡率分别为(0.59±0.20)%、(37.46±6.22)%、(27.18±4.03)%、(26.01±5.54)%,模型组细胞凋亡率均明显高于其他组(P均<0.05),香芹酚高、低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组胞浆Cyt C释放量比较 假手术组、模型组、香芹酚低剂量组、香芹酚高剂量组胞浆Cyt C释放量分别为(11.48 ± 1.75)ng/mg pro、(120.59 ± 10.63)ng/mg pro、(82.21 ± 12.14)ng/mg pro、(79.30 ± 13.35)ng/mg pro,模型组胞浆Cyt C释放量均明显高于其他组(P均<0.05),香芹酚高、低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4各组胞浆中Caspase-3和Caspase-9活性比较 模型组心肌细胞胞浆中Caspase-3和Caspase-9活性均显著高于其他组(P均<0.05),香芹酚高、低剂量组间Caspase-3和Caspase-9活性比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 假手术组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌细胞胞浆中Caspase活性比较

2.5各组心肌组织中凋亡相关基因mRNA表达量比较 模型组心肌组织中Bcl-2 mRNA相对表达量均明显低于其他组(P均<0.05),Bax mRNA相对表达量均明显高于其他组(P均<0.05),香芹酚高、低剂量组间Bcl-2和Bax mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 假手术组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax mRNA相对表达量比较

3 讨 论

MIRI所涉及的病理生理机制极为复杂,包括氧化应激、炎症反应、能量代谢障碍、钙超载等。近年来“细胞凋亡学说”受到重视,认为心肌细胞凋亡异常是MIRI过程中一种重要的病理机制[9]。生理条件下,细胞凋亡有助于维持细胞增殖和细胞死亡间的平衡;MIRI发生时,冠脉再灌注不仅给缺血心肌组织提供赖以生存的氧气和葡萄糖,同时也为细胞凋亡提供了能量,此时凋亡可诱导过度的细胞死亡,导致不可逆的心肌损害,降低心功能。相关临床研究发现,心肌梗死患者行再灌注治疗时,再灌注时间越晚,心肌细胞凋亡现象越明显[10]。动物实验研究亦表明,MIRI大鼠心肌组织与正常大鼠比较,其凋亡细胞显著增多,缺血再通区域以凋亡细胞为主[11];大鼠冠脉缺血6 h后的心肌细胞凋亡指数最高,凋亡关键蛋白Caspase-3、Caspase-9活性在缺血3 h开始升高,6 h达高峰[12]。本实验采用冠脉结扎45 min再灌注6 h的方法建立MIRI动物模型,结果模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著增高,证实细胞凋亡参与MIRI过程。故探讨如何有效抑制再灌注后的细胞凋亡,保护受损的心肌,对MIRI防治具有重要意义。

研究表明,某些药物可通过激活机体自身保护机制或促使释放内源性活性物质,增强损伤心肌组织对缺血、缺氧的耐受性,实现对MIRI的保护作用[13]。本实验结果显示,香芹酚高、低剂量组心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率均明显低于模型组,提示香芹酚预处理可抑制心肌细胞凋亡,减轻 MIRI 过程中心肌损伤。

由线粒体启动、受Bcl-2家族调控、Caspase-9直接参与的线粒体传导途径是重要的内源性凋亡通路。MIRI 发生时,心肌细胞线粒体膜通透性转换孔由于受到多种应激因素如氧自由基、钙超载等影响而异常开放,线粒体中Cyt C大量释放到胞浆。一方面,Cyt C的释放诱导位于胞浆的促凋亡因子Bax进入线粒体,促进凋亡反应;另一方面,Cyt C与Caspase-9结合成复合体,启动Caspases级联反应,最终激活凋亡执行因子Caspase-3而引发心肌细胞凋亡[14]。抗凋亡因子Bcl-2位于线粒体外膜,通过调节线粒体膜通透性转换孔,减少Cyt C的释放;还可与Bax结合成异源二聚体,抑制凋亡反应。既往实验研究发现过表达Bcl-2可明显阻抑MIRI大鼠心肌细胞凋亡[15]。本实验中,模型组大鼠胞浆Cyt C释放量、胞浆中Caspase-3和Caspase-9活性、心肌组织中Bax mRNA表达量均显著上调,心肌组织中Bcl-2 mRNA表达量则显著下调,提示冠脉缺血45 min再灌注6 h后,线粒体凋亡途径被激活并参与了MIRI的病理进程;香芹酚低、高剂量组胞浆Cyt C释放量、胞浆中Caspase-3和Caspase-9活性、心肌组织中Bax mRNA表达量均显著下调,心肌组织中Bcl-2 mRNA表达量显著上调,说明香芹酚预处理可抑制Cyt C由线粒体易位至胞浆的释放量,可减少Caspase-3和Caspase-9的活化,其通过抑制线粒体凋亡途径,减轻MIRI过程中的心肌细胞凋亡反应。

综上,香芹酚预处理对MIRI的心肌保护作用与抑制线粒体凋亡途径、减轻心肌细胞凋亡反应等有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。