清肺通络敷胸方调控RORγt/Foxp3+干预呼吸道合胞病毒肺炎幼鼠炎性损伤的机制

王 蕾,张秀英,杨梦菲,刘 清,赵航宇,瞿圣岳,郭天祥

(1. 辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110032;2. 辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032)

呼吸道合胞病毒(RSV)感染是小儿肺炎住院的主要原因[1]。2015年全球约有33 100万RSV所致的呼吸道感染在儿童中发生,导致约300万儿童住院,有66 000～199 000名5岁以下儿童死于RSV相关急性呼吸道感染,其中99%的死亡发生在发展中国家[2-3]。虽然经过科学家们的不懈努力,已有多种疫苗在研究中,但其可靠性仍未得到证实,目前尚未有获准上市的RSV疫苗[4-5]。在临床实践中,清肺通络敷胸方对RSV肺炎有很好的疗效,动物实验证实该方可降低肺组织病毒载量,减轻肺损伤[6]。本实验进一步观察了清肺通络敷胸方对RSV感染肺炎幼鼠肺部转录因子维甲酸相关孤儿受体(RORγt)/叉头翼状螺旋转录因子3(Foxp3+)及相关炎性因子表达的影响,探讨清肺通络敷胸方干预RSV肺炎的作用途径。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠36只,3周龄,体重50～70 g,购于辽宁长生生物科技有限公司,动物合格证号:SYXK(辽)2020-0001。(20±2)℃常温饲养,每日给予正常饮食。本实验经辽宁中医药大学附属医院动物实验伦理委员会审核通过(21000042022038)。

1.2病毒及药物 RSV-long株来源于首都儿科研究所,冻存于辽宁中医药大学附属医院病毒室,半数组织培养感染量(TCID50)为10-3。清肺通络敷胸方以大黄、黄芩为君臣药,药物均购于辽宁中医药大学中药局。 按照大黄粉、黄芩粉、大蒜泥1∶1∶1的比例称取,用70%乙醇进行2次回流,分别提取1.5 h、2 h,每次乙醇体积均为所用药材的6倍,混合2次药液,减压风干为粉末避光保存。取粉末加水调成膏状备用,生药量0.6 g/贴。

1.3主要试剂 多聚甲醛、石蜡、幼鼠肺脏肺泡灌洗液、PBS(北京索莱宝科技有限公司,批号分别为G1120,G1340,P8860,2038149);1640 培养基(以色列BI公司,批号:01-100-1ACS);RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、30% Acr-Bis(29∶1)、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液、ECL发光液(中国碧云天公司,货号分别为P0013B,ST506,P0009,ST003,P0015, P0018);PVDF膜(美国Millipore公司,货号为IPVH00010);RORγt antibody,Foxp3+antibody(中国武汉三鹰公司,货号为13205-1-AP,22228-1-AP);羊抗兔IgG-HRP(美国Thermo公司,货号为31210);内参抗体 GAPDH(中国Bioss公司,货号为10900R);TRIzol(美国Thermo公司,货号为1596-026);HiFiScript cDNA Synthesis Kit,SYBR Mixture(北京康为世纪公司,货号为CW2569M,CW2601M);Respiratory syncytial virus、RORγt、Foxp3+引物由苏州金唯智生物公司合成;白细胞介素-17(IL-17)和白细胞介素-10(IL-10)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物公司,货号分别为SEKR-0007,SEKR-0006)。

1.4仪器 全外排Ⅱ级生物安全柜(美国Baker公司,型号为SG403TXCE), 精密轮转切片机、石蜡包埋机(德国LEICA公司,型号为RM2135RM2135,EG115),系统生物显微镜(日本OLYPUS公司,型号为BX50F4),水平摇床、电泳仪、转移槽、双垂直蛋白电泳仪、凝胶成像系统(北京北京六一公司,型号分别为WD-9405B,DYY-7C,DYCZ-40D,DYCZ-24DN,WD-9413B型),微量移液器(苏州BIOHIT公司,型号为Proline),超纯水系统(香港Heal Force公司,型号为NW10LVF),超速冷冻离心机(长沙湖南湘仪公司,型号为H-2050R),酶标仪(美国BIOTEK公司,型号为ELX-800),电热恒温培养箱(天津天津泰斯特公司,型号为DH36001B),真空干燥箱(上海SYSBERY,型号为DZF-6050),紫外分光光度计(美国Thermo公司,型号为NANO 2000),荧光定量PCR仪(美国Thermo公司,型号为QuantStudio3)。

1.5实验方法 将36只SD幼鼠按随机数表法分为正常组、RSV肺炎组、清肺通络敷胸方组,每组12只。参考文献[7]方法,RSV肺炎组和清肺通络敷胸方组幼鼠腹腔注射0.2 mL 10%水合氯醛轻度麻醉后,采用10 TCID50 RSV病毒液滴鼻,每鼻孔25 μL,连续滴3 d;正常组给予不含病毒的生理盐水50 μL/只滴鼻3 d。第3天滴鼻后,清肺通络敷胸方组给予清肺通络敷胸膏1.5 g均匀涂抹于幼鼠背部(脊柱两侧脱毛,范围3 cm×5 cm),用医用纱布及胶布固定,1 h后温水清理皮肤,1次/d,连续7 d。

1.6标本采集 于干预第3天和干预第7天,每组随机取6只幼鼠,禁食禁水8 h后断颈处死,在无菌条件下取出整个肺脏,用无菌生理盐水冲洗2遍,留取肺泡灌洗液用于ELISA检测,取肺叶放于多聚甲醛中固定用于HE染色病理观察,部分肺组织液氮冷冻用于蛋白及mRNA检测。

1.7检测指标及方法

1.7.1肺组织病理形态 将固定好的标本行石蜡包埋,切片,经HE染色、中性树胶封固后显微镜观察照相。

1.7.2肺组织中RORγt、Foxp3+蛋白表达情况采用Western blot法检测:取幼鼠肺脏组织,按试剂盒法提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品20 μg进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭。加 Foxp3+一抗(1∶1 000)、RORγt一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜,PBST洗膜3次,加二抗(1∶10 000)室温孵育2 h,PBST洗膜3次,ECL底物发光,凝胶图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

1.7.3肺组织中ROR-γt、Foxp3+mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测:取幼鼠肺组织,采用TRIzol法提取细胞总RNA,用HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成cDNA,用SYBR Mixture试剂盒测定。以总RNA为模板合成 cDNA,进行PCR反应。扩增条件:950 ℃ 30 s;循环40次,72 ℃ 2 min 30 s,40 ℃ 1 min 30 s,60 ℃ to 94 ℃,每1.0 ℃ 1 s,25 ℃ 2 min。在PCR扩增结束后,以2-△△CT表示mRNA相对表达量。RORγt上游引物序列为5’-CTTCATGGAGCTGTGCCAGA-3’,下游引物序列为5’-AGACTGTGTGGTTGTTGGCA-3’,引物长度100 bp;Foxp3+上游引物序列为5’-CTGGGATCAATGTGGCCAGT-3’,下游引物序列为5’-TCGAAGGCCTTCTCACAACC-3’,引物长度81 bp。

1.7.4肺泡灌洗液中IL-17、IL-10含量 取幼鼠肺泡灌洗液,严格按照 ElISA 试剂盒说明书进行操作,检测各组幼鼠IL-17、IL-10含量。

2 结 果

2.1各组幼鼠肺组织病理形态 正常组幼鼠肺组织均呈淡粉色,表面湿润有光泽,弹性好,且质地柔软,无实变;光镜下幼鼠肺间隔及支气管完整,肺泡结构正常。干预第3天,RSV肺炎组和清肺通络敷胸方组幼鼠肺组织大体解剖无明显改变,镜下见肺泡壁上皮细胞轻微受损,肺间隔增宽不明显,肺间质见少量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞浸润。干预第7天,RSV肺炎组幼鼠肺组织出现豆腐渣样改变,间质损伤,镜下见肺泡壁明显增厚,肺间质见大量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞浸润;清肺通络敷胸方组幼鼠肺泡壁增厚不明显,肺间质见微量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞浸润。见图1。

2.2各组幼鼠肺组织中RORγt和Foxp3+蛋白表达情况 干预第3天和第7天,RSV肺炎组和清肺通络敷胸方组肺组织中RORγt蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05),Foxp3+蛋白相对表达量均明显低于正常组(P均<0.05);干预第3天和第7天,清肺通络敷胸方组肺组织中RORγt蛋白相对表达量均明显低于RSV肺炎组(P均<0.05),Foxp3+蛋白相对表达量均明显高于RSV肺炎组(P均<0.05)。见图2及表1。

图2 正常组及呼吸道合胞病毒肺炎幼鼠肺组织中RORγt和Foxp3+蛋白表达显影

表1 正常组及呼吸道合胞病毒肺炎各组幼鼠肺组织中RORγt和Foxp3+蛋白相对表达量比较

2.3各组幼鼠肺组织中ROR-γt和Foxp3+mRNA表达情况 干预第3天和第7天,RSV肺炎组和清肺通络敷胸方组肺组织中RORγt mRNA相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05),Foxp3+mRNA相对表达量均明显低于正常组(P均<0.05);干预第3天和第7天,清肺通络敷胸方组肺组织中RORγt mRNA相对表达量均明显低于RSV肺炎组(P均<0.05),Foxp3+mRNA相对表达量均明显高于RSV肺炎组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组及呼吸道合胞病毒肺炎各组幼鼠肺组织中RORγt和Foxp3+mRNA相对表达量比较

2.4各组幼鼠肺泡灌洗液中IL-17和IL-10含量 干预第3天和第7天,RSV肺炎组和清肺通络敷胸方组肺泡灌洗液中IL-17含量均明显高于正常组(P均<0.05),IL-10含量均明显低于正常组(P均<0.05);干预第3天和第7天,清肺通络敷胸方组肺泡灌洗液中IL-17含量均明显低于RSV肺炎组(P均<0.05),IL-10含量均明显高于RSV肺炎组(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组及呼吸道合胞病毒肺炎各组幼鼠肺泡灌洗液中IL-17和IL-10含量比较

3 讨 论

RSV是引起儿童肺炎的主要病原[8],临床迫切需要有效治疗RSV肺炎的方法。中医认为小儿为“纯阳之体”,具有“脏腑娇嫩,形气未充”的生理特点。钱乙在《小儿药证直诀》中提出“五脏六腑,成而未全,全而未壮”,吴鞠通在《温病条辨》中形容“且其脏腑薄,藩篱疏,易于传变;肌肤嫩,神气怯,易于感触”,这些生理特点都与临床中小儿卫外不完善,易受外邪侵袭的表现相对应。RSV属于外邪,侵袭肺卫,又因小儿为“肺常不足”“阳常有余”之体,所以容易化为肺热。故用清肺通络敷胸方清解肺热,其理论依据取自经络理论的“肺与大肠相表里”,为“通大肠以清肺解毒”之意[9]。该方中大黄归脾经、胃经、大肠经、肝经、心包经,黄芩归肺、胆、胃、大肠经,大蒜归脾、胃、肺、大肠经,药味多苦寒,以清肺热,归经皆有大肠经,循经络表里入肺经。现代药理学研究表明,黄芩和大黄中的活性成分均可抑制RSV病毒[10-11]。

目前研究表明,RORγt、Foxp3+的表达能起到调节微生物群启动免疫作用[12]。RORγt介导的IL-17转录是炎症性疾病发病的核心[13]。CD4+Foxp3+调节性T细胞能调节IL-10的释放[14]。RSV肺炎患儿IL-10水平显著升高,且RSV感染的调节性B淋巴细胞(nBreg)可通过产生IL-10来增加感染严重性[15-16]。IL-17是RSV感染过程的重要媒介,与肺炎严重程度密切相关[17]。本实验结果显示,RSV肺炎组肺组织中RORγt蛋白及mRNA相对表达量和肺泡灌洗液中IL-17含量均明显升高,肺组织中Foxp3+蛋白及mRNA相对表达量和肺泡灌洗液中IL-10含量均明显降低;与RSV肺炎组比较,清肺通络敷胸方组干预第3天和第7天肺组织中RORγt蛋白及mRNA相对表达量和肺泡灌洗液中IL-17含量均明显降低,肺组织中Foxp3+蛋白及mRNA相对表达量和肺泡灌洗液中IL-10含量均明显升高。据此可以推断,清肺通络敷胸方外敷可通过调节RORγt、Foxp3+的表达而影响IL-10、IL-17的释放,从而减轻炎症反应,发挥肺保护作用,进一步丰富了清肺通络敷胸方治疗RSV肺炎的理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。