逐瘀清心胶囊对精神分裂症大鼠神经组织及髓鞘病变影响及机制

彭爱能,赵玉萍,赵永厚,于 明,柴剑波

(1. 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2. 黑龙江神志医院,黑龙江 哈尔滨 150036)

精神分裂症是以情感、意识、思维障碍为主要表现的精神疾病,髓鞘结构异常以及功能障碍参与了该病的发生发展[1]。中医认为精神分裂症是由于先天禀赋不足或后天情志不畅,气血失和,脏腑功能紊乱,气、痰、瘀、火相互搏结,阻滞清窍,脑神被扰,引起神志异常的疾病[2]。中医对于精神分裂症,尤其是恢复期精神分裂症有较好的治疗效果,可有效缓解患者焦虑、抑郁、认知功能障碍等症状,且安全性较高[3]。瘀与火是精神分裂症发病中重要的病理因素,逐瘀清心胶囊是针对精神分裂症瘀热互结的特点化裁而来,功专化瘀清热、开窍醒神。本实验通过观察精神分裂症大鼠脑额叶皮质、海马、扣带中分化抑制因子2(Id2)、少突胶质细胞转录因子1(Olig1)、少突胶质细胞转录因子2(Olig2)蛋白表达情况,旨在明确逐瘀清心胶囊对精神分裂症大鼠神经组织及髓鞘病变的影响及作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只,8周龄,体重180～220 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号:SCXK(辽)2020-0001。大鼠饲养于黑龙江中医药大学动物实验中心,室温22～26 ℃,湿度55%～60%,自然光线,自由饮食。

1.2药品 逐瘀清心胶囊(主要成分为半夏、制南星、三棱、莪术、大黄、茵陈蒿等),黑龙江神志医院院内制剂,批号:Z20100270,规格:0.40 g/粒;取逐瘀清心胶囊粉末加蒸馏水制备成混悬液, 生药含量为0.054 g/mL。利培酮片,江苏恩华药业,国药准字H20050160,规格:1 mg/片;取利培酮片研磨成粉末,加蒸馏水制备成混悬液,生药含量为0.0 036 mg/mL。

1.3试剂与仪器 无水乙醇(HAC0057,天津永大),苏木素(C0107,Beyotime),伊红(C0105M,Beyotime),石蜡(39601095,Leica),劳克坚牢蓝(LFB,G3245,Solarbio),磷酸盐缓冲液(PBS,MA0016,Meilunbio)。高压蒸汽灭菌器(MLS-3751L-PC,Panasonic),纯水系统(TANKPE0600,Millipore),显微镜(BX53,OLYMPUS),制冰机(IMS-50,雪科),脱水机(KD-TS3A,科迪),生物组织摊烤烘片机(KD-TI,科迪),轮转式切片机(HistoCore MULTICUT,Leica),低温离心机(SORVALL ST8/8R,Thermo),冷冻包埋机(KD-BMIII、BLIII,科迪)。

1.4分组、造模及给药 将40只大鼠随机分为空白组、模型组、逐瘀清心组、利培酮组,每组10只。模型组、逐瘀清心组、利培酮组大鼠给予MK-801药液0.1 mg/(kg·d)腹腔注射建立精神分裂症模型,空白组给予等剂量生理盐水腹腔注射,均1次/d,连续注射14 d。造模成功后,逐瘀清心组给予逐瘀清心胶囊混悬液0.054 g/(kg·d)灌胃,利培酮组给予利培酮混悬液0.036 mg/(kg·d)灌胃,空白组及模型组给予等量蒸馏水灌胃,均1次/d,连续灌胃28 d。

1.5标本采集 灌胃结束后,每组各取大鼠5只,用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,快速断头剥离取出大鼠完整脑组织,经生理盐水漂洗后放入冷冻管中,液氮速冻固定,-80 ℃冰箱保存,以备于Western blot检测;剩余各组大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,待进入麻醉状态后采用心脏灌流术灌流取脑,剥离脑组织后置于4%多聚甲醛固定液中,4 ℃固定48 h,将固定好的样本脱水,石蜡包埋,切片,厚度为4 μm,以备于HE染色和LFB染色。

1.6观察指标及方法

1.6.1脑组织病理形态 取上述石蜡切片脱蜡水化,苏木素染色10 min,双蒸水洗片2次,各1 min,分化液分化3 s,50 ℃温水洗片3次,各5 min,伊红染色30 s,各梯度乙醇、二甲苯脱水透明,中性树胶封片,显微镜观察。

1.6.2脑白质脱髓鞘病变情况 取上述石蜡切片脱蜡水化,加LFB染色液,室温过夜,95%乙醇洗去多余浮色液,蒸馏水冲洗,Luxol分化液分化15 s,70%乙醇分化30 s,水洗,显微镜观察,直至灰质和白质轮廓分明,用95%乙醇、100%乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜观察。

1.6.3脑额叶皮质、海马、扣带组织中Id2、Olig1、Olig2蛋白表达情况 Western blot法检测:取上述-80 ℃保存的脑组织,加入适量Complete RIPA Buffer制备组织匀浆液,4 ℃下13 000 r/min离心10 min,取上清,BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白溶液,加入5×Protein Loading Buffer,100 ℃金属浴5 min,上样,电泳,以湿转方式转移蛋白至PVDF膜,封闭液封闭2 h,将PVDF膜全部浸没在稀释的一抗中,4 ℃孵育过夜,1×TBST洗膜4次,每次15 min,将PVDF膜全部浸没在稀释的二抗中,室温孵育1h,1×TBST洗膜4次,每次15 min,将膜浸于ECL发光液中,避光显色2 min,置于全自动化学发光图像分析系统扫描。

1.7统计学方法 采用IBM SPSS 25.0软件对数据进行分析,先进行正态性检验和方差齐性检验,符合正态分布且方差齐,多组间比较采用单因素方差分析(one-way RANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠脑组织病理形态 HE染色显示:空白组大鼠神经元细胞形态规则,胞质均匀,无明显核固缩现象;模型组大鼠神经元细胞形态不规则,细胞核固缩或溶解现象明显;与模型组比较,逐瘀清心组和利培酮组大鼠神经元细胞核固缩或溶解现象减轻,细胞形态较为规则,仅见少量核固缩、核溶解现象;与利培酮组比较,逐瘀清心组大鼠神经元细胞排列紧密,形态规则,核固缩、核溶解现象更少见,整体更趋近于正常。见图1。

图1 空白组和精神分裂症各组大鼠脑组织病理形态(HE染色,×400)

2.2各组大鼠脑白质脱髓鞘病变情况 LFB染色

显示:空白组大鼠脑白质髓鞘组织致密,分布规则,少突胶质细胞数量正常;模型组大鼠脑白质髓鞘组织稀疏,有明显的染色断裂,即神经纤维表现出明显脱髓鞘病变;与模型组比较,逐瘀清心组和利培酮组大鼠髓鞘结构更加完整,排列规则,少突胶质细胞数量增加;与利培酮组比较,逐瘀清心组少突胶质细胞数量更多,髓鞘更完整,脱髓鞘病变进一步减轻。见图2。

图2 空白组和精神分裂症各组大鼠脑白质脱髓鞘病变情况(LFB染色,×400)

2.3各组大鼠额叶皮质、海马、扣带组织中Id2、Olig1、Olig2蛋白表达情况 模型组大鼠脑额叶皮质、海马、扣带组织中Id2蛋白表达量均明显高于空白组(P均<0.05),逐瘀清心组和利培酮组上述各部位组织中Id2蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05);模型组大鼠脑额叶皮质、海马、扣带组织中Olig1和Olig2蛋白表达量均明显低于空白组(P均<0.05),逐瘀清心组和利培酮组上述各部位组织中蛋白表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。见图3。

图3 空白组和精神分裂症各组大鼠脑额叶皮质、海马、扣带组织中Id2、Olig1、Olig2蛋白表达情况

3 讨 论

精神分裂症是最常见的精神疾病,该病所致残疾人口约占总残疾人口的3.75%,在所有的精神病性障碍中占比最高[4]。神经发育障碍是精神分裂症发生的重要机制之一,白质异常和中间神经元功能障碍是精神分裂症患者最常见的细胞神经病理学改变[5]。有研究表明,精神分裂症患者的少突胶质细胞及髓鞘完整性异于正常人[6]。Id2是神经系统髓鞘形成的负调控因子,对中枢神经系统中少突胶质细胞的分化有负性调节作用,通常在神经损伤后上调,与神经再生及修复有关[7]。一项关于坐骨神经损伤修复的研究发现,Id2基因过表达可加速坐骨神经挤压后神经轴突再生,促进神经损伤后神经肌肉接头的再支配,促进神经传导及神经肌肉功能恢复[8]。Olig1、Olig2属于少突胶质细胞转录因子,参与调控少突胶质细胞的发育分化。在神经发育过程中,神经前体细胞分化为少突胶质细胞,Olig2因子影响早期前体细胞向少突胶质细胞转化的过程,从而对髓鞘发育产生影响[9]。陈显军[10]研究发现,Olig2基因敲除小鼠大脑皮质少突胶质细胞发育不良,并出现明显的认知功能缺陷、社交回避等精神分裂症样行为。Olig1在少突胶质细胞成熟后期和髓鞘形成过程中起关键作用,Olig1基因缺失的小鼠少突胶质细胞成熟时间延迟[11]。

精神分裂症中医病名为“癫狂”,瘀与热是癫狂病的重要病理因素,瘀久易化热,瘀热互结,阻塞脑络,热甚扰动心神,使神志错乱。逐瘀清心胶囊主要成分为大黄、川芎、丹参、三棱、枳实、琥珀、生龙骨、生牡蛎,全方清热活血、逐瘀通窍。组方中大黄泻热逐瘀,引热下行排出体外;三棱、川芎活血行气,枳实行气,气行推动血行;琥珀、生龙骨、生牡蛎重镇安神,滋阴潜阳;丹参活血祛瘀,清心除烦;全方活血清热之力强,佐以重镇安神之品,使积聚日久的瘀热之邪消散,脑络通畅,阴阳归位,神志安和,精神状态好转。现代药理学研究表明,大黄中大黄素具有抗炎、抗氧化应激作用,对脂多糖(LPS)诱导的炎症反应与氧化应激损伤有抑制作用[12]。川芎中活性成分川芎嗪可通过抑制一氧化氮、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β释放,起到抑制神经炎症的作用;阿魏酸则可通过减少活性氧(ROS)生成及调节乳酸脱氢酶(LDH)水平发挥抗氧化应激作用[13]。精神分裂症患者血清胆碱酯酶活性常高于正常人,而丹参酮具有抑制胆碱酯酶活性的作用[14]。枳实中的枳实黄酮可降低6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞中ROS水平,具有抗神经细胞损伤作用[15]。

本实验结果显示,模型组大鼠存在明显神经损伤及脑白质脱髓鞘病变,额叶皮质、海马、扣带中Id2蛋白表达上调,Olig1、Olig2蛋白表达下调;逐瘀清心组大鼠神经损伤及脑白质脱髓鞘病变均明显减轻,额叶皮质、海马、扣带中Id2蛋白表达下调,Olig1、Olig2蛋白表达上调。说明逐瘀清心胶囊可明显减轻精神分裂症大鼠神经组织损伤,其机制可能与调控脑额叶皮质、海马、扣带中Id2、Olig1、Olig2蛋白的表达,从而修复脑白质脱髓鞘病变有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。