芪地糖肾方对糖尿病肾病小鼠肾脏病变及血清Klotho、MMP-9/TIMP-1的影响

史 扬,周 盈,安至超,郭 燕,郑毅成,董昭熙,柳红芳

(1. 北京中医药大学东直门医院,北京 100700;2. 北京中医药大学房山医院,北京 102400)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的慢性、致死性并发症之一,以细胞外基质(ECM)过度堆积进而导致肾小球基底膜增厚为首现的关键病理改变[1]。目前缺乏对抗DN进展的有效治疗手段,其引起的终末期肾脏病已成为世界难题。高糖病理环境下,基质金属蛋白酶(MMPs)/组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)酶系调节系统作用失常以及Klotho等抗纤维化因子表达的下调是ECM过量积聚的重要原因[2-3]。芪地糖肾方是北京中医药大学第一临床医学院柳红芳教授的经验方,具有填补肾精、通络除痹之效,可降低尿蛋白,改善肾脏微炎症状态,下调纤维化因子表达,保护肾功能[4-8]。本实验通过观察DN小鼠血清Klotho、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)及肾脏病理形态和超微结构的变化,进一步探究了芪地糖肾方的作用机制,以期为该方的临床应用提供更多的依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF清洁级雄性db/db小鼠36只,8周龄,体重(30±6)g;同周龄SPF清洁级雄性db/m小鼠12只,体重(20±5)g。小鼠均由江苏卡文斯实验动物有限公司提供,动物合格证号:SCXK(苏)2016-0010。所有小鼠饲养于北京中医药大学东直门医院屏障级动物室,自由进食水,昼夜交替光照12 h,温度(22±2)℃,湿度(55±10)%。本研究已通过北京中医药大学东直门医院动物福利与伦理委员会的审查(20-25)。

1.2药物与试剂 芪地糖肾方由熟地黄、生黄芪、炒芡实、山萸肉、水蛭、熟大黄、白花蛇舌草组成,由北京中医药大学第三附属医院药房制作成颗粒剂。缬沙坦胶囊,北京诺华有限公司生产。按照小鼠与人等效剂量(9∶1)计算小鼠芪地糖肾颗粒每日用量为3.33 g/kg,缬沙坦胶囊每日用量为10.29 mg/kg(用时打开胶囊称重)。小鼠血清Klotho、MMP-9、TIMP-1及尿白蛋白检测ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司(产品编号:ml057910,ml037717,ml037716,ml063626)。

1.3实验方法 对所有小鼠进行6周适应性喂养,14周龄时将db/db小鼠随机分为模型组、缬沙坦组、芪地糖肾方组,每组12只;db/m小鼠12只作为正常组。芪地糖肾方组给予3.33 g/kg芪地糖肾颗粒水溶液灌胃,缬沙坦组给予10.29 mg/kg缬沙坦水溶液灌胃,正常组、模型组给予等量的生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃12周。

1.4观察指标

1.4.1尿蛋白水平 于各组小鼠末次灌胃后,禁食不禁水12 h,收集尿液,采用ELISA法检测尿微量白蛋白水平,计算12 h尿白蛋白水平(12 h尿白蛋白水平=尿微量白蛋白水平×12 h总尿量)。

1.4.2肾重体重比值 收集尿液后称各组小鼠体重,以2%戊巴比妥钠麻醉小鼠,取左肾,称重量,计算肾重体重比值。

1.4.3血清Klotho、MMP-9、TIMP-1水平 麻醉后摘眼球取血,4 ℃下3 000 r/min离心15 min,取上层血清,采用ELISA法检测血清Klotho、MMP-9、TIMP-1水平,计算MMP-9/TIMP-1。

1.4.4肾脏组织超微病理结构 取右肾,沿冠状面剖开,切至1 mm3大小,放入2.5%戊二醛的避光西林瓶中固定24 h后制作电镜切片,于电镜下观察肾脏超微病理结构;采用Image J软件进行电镜图像分析,每组小鼠于10 000倍下各采集10个视野,每个视野随机测量5处肾小球基底膜厚度,计算平均值。

1.4.5肾脏组织病理形态 取经4%甲醛固定24 h后的肾组织,常规脱水,石蜡包埋,使用切片机制作4 μm厚切片,分别进行HE染色及Masson染色,于光镜下观察肾脏病理形态。

2 结 果

2.1各组小鼠12 h尿白蛋白水平及肾重体重比值比较 与正常组比较,模型组、缬沙坦组、芪地糖肾方组小鼠12 h尿白蛋白水平均明显升高(P均<0.05),模型组、缬沙坦组小鼠肾重体重比值均明显降低(P均<0.05);缬沙坦组、芪地糖肾方组小鼠12 h尿白蛋白水平均明显低于模型组(P均<0.05),芪地糖肾方组小鼠肾重体重比值明显高于模型组(P<0.05),缬沙坦组与芪地糖肾方组12 h尿白蛋白水平、肾重体重比值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和糖尿病肾病各组小鼠12 h尿白蛋白水平及肾重体重比值比较

2.2各组小鼠血清Klotho、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比较 与正常组比较,模型组小鼠血清Klotho水平明显降低(P<0.05),血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,缬沙坦组、芪地糖肾方组小鼠血清Klotho水平均明显升高(P均<0.05),血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均明显降低(P均<0.05),缬沙坦组与芪地糖肾方组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和糖尿病肾病各组小鼠血清Klotho、MMP-9/TIMP-1水平比较

2.3各组小鼠肾脏组织电镜下表现 正常组小鼠肾脏超微结构清晰,少见足突融合,肾小球基底膜厚度为(150.94±17.89)nm,且均匀;模型组小鼠肾脏超微结构模糊紊乱,足突融合现象多见,肾小球基底膜厚度为(282.60±27.72)nm,明显高于正常组(P<0.05);缬沙坦组、芪地糖肾方组小鼠肾脏超微结构较清晰有序,足突融合现象较少见,肾小球基底膜厚度分别为(205.32±22.81)nm、(170.08±27.69)nm,均明显低于模型组(P均<0.05),且芪地糖肾方组明显低于缬沙坦组(P<0.05)。见图1。

图1 正常组和糖尿病肾病各组小鼠肾脏组织电镜下表现(×10 000)

2.4各组小鼠肾脏组织HE染色表现 正常组小鼠肾小球及肾小管结构完整、清晰,未见明显病理改变;模型组小鼠肾脏组织可见肾小球毛细血管基底膜增厚,肾小管上皮细胞呈空泡样变性、管腔扩张;缬沙坦组、芪地糖肾方组小鼠肾脏组织细胞排列较整齐,基底膜增厚及小管空泡变性等病理变化均明显改善。见图2。

图2 正常组和糖尿病肾病各组小鼠肾脏组织HE染色表现(×400)

2.5各组小鼠肾脏组织Masson染色表现 正常组小鼠肾小球及肾小管结构完整、清晰,未见明显蓝染胶原纤维;模型组小鼠系膜基质增生,基底膜弥漫性增厚,肾间质可见明显蓝染胶原纤维;缬沙坦组、芪地糖肾方组小鼠肾脏组织呈现局灶性蓝染胶原纤维沉积,纤维化面积较模型组明显减少。见图3。

图3 正常组和糖尿病肾病各组小鼠肾脏组织Masson染色表现(×400)

3 讨 论

DN是在长期高糖的病理环境下,机体出现的慢性、不可逆的肾脏结构及功能损害。DN早期以ECM积累为特征性病理表现,并逐渐出现肾小球基底膜及系膜增厚、基质增生,最终导致肾小球硬化及间质纤维化。肾小球基底膜增厚是DN最早出现的肾脏结构变化,多种细胞因子参与调节该病理过程[9-10]。肾小球基底膜是肾小球毛细血管壁的关键组成部分,其作为肾小球内足细胞及内皮细胞的分隔层,对于支持肾小球选择性滤过功能有至关重要的作用[11],靶向修复肾小球基底膜的治疗手段可有效减少蛋白尿并延缓肾衰竭的发生[12-14]。

目前研究认为MMPs/TIMPs酶系调节系统参与调控ECM的生成与降解。MMPs参与ECM的降解,正常情况下其活性较低,在组织损伤重塑及炎症修复过程中被激活,TIMPs可抑制MMPs的活性;生理状态下,MMPs/TIMPs处于平衡状态以维持肾脏ECM的生理性形态,保证肾小球基底膜结构及功能正常,二者关系的失衡是ECM过量沉积的重要原因[15-16]。在MMPs/TIMPs酶系调节系统中,MMP-9、TIMP-1是关键的作用因子,TIMP-1对MMP-9有高度特异性抑制作用,二者水平与DN存在着密切关联[17],血清MMP-9、TIMP-1水平及二者比值可反映ECM积聚情况[18]。Klotho蛋白又被称为抗衰老抑制剂,其高表达可以抑制高糖环境下肾脏固有细胞中ECM的过度沉积[19],可通过影响炎症、氧化应激、纤维化等相关通路发挥抑制DN病程进展的作用[20];其血清水平可反映肾纤维化程度,可作为糖尿病继发肾病的早期预测因子[21-22]。

中医认为DN中ECM过度沉积及肾小球基底膜增厚等病理改变总因瘀滞痰毒等邪阻结肾络所成[23]。柳红芳教授根据临证经验,认为该病核心病机可以概括为精损络痹[24],以“填精通络”为核心治法自拟芪地糖肾方,临床效验明确且已通过国家专利审批(专利号:ZL201711097315.2)。方中以熟地黄填补肾精,直达病源;以生黄芪补气生精,精气共活;以炒芡实、山萸肉益肾固精;以水蛭、熟大黄、白花蛇舌草通肾络、除痹阻以助肾精敷布;全方以填补肾精、祛邪通络为大法,使肾精之中空得填,肾络之瘀热湿痹等邪得除,诸药并用以达虚实并济、标本兼调之效。既往实验研究表明,该方可通过影响自噬、肠道菌群及胰岛素抵抗等相关信号通路靶点有效降低DN动物模型的蛋白尿,减轻肾脏纤维化程度[25-27]。

db/db小鼠是目前公认的较为理想并具有良好稳定性的DN动物模型,该类小鼠在8周龄时即出现典型的高血糖表现,12～14周龄出现肾小球基底膜增厚、系膜基质增加等肾脏病理改变;与其他鼠系相比,db/db小鼠在高血糖影响下出现进行性肾脏损害,且该鼠系的肾脏结构变化与临床DN患者最为相似[28-29]。故本实验以db/db小鼠作为DN研究模型,并选择同窝杂合子db/m小鼠作为正常对照,从影响ECM沉积、肾小球基底膜角度探讨了芪地糖肾方对DN的保护作用机制。

本实验研究结果显示,模型组小鼠肾重体重比值显著降低,芪地糖肾方组小鼠肾重体重比值回升,这可能与治疗后芪地糖肾方组小鼠体重稍有下降而模型组小鼠体重持续上升有关;模型组小鼠血清Klotho水平明显降低,尿白蛋白水平及血清MMP-9、TIMP-1水平和MMP-9/TIMP-1明显升高,缬沙坦组、芪地糖肾方各指标均明显改善,这与目前临床研究结果有相似之处,但血清中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1可能受到药物及糖尿病其他并发症等的影响[18],其对DN肾脏病变程度的预测作用有一定的参考价值,但尚缺乏特异性,临床实践中应结合其他理化指标综合评估。电镜观察肾脏超微结构及肾脏形态显示DN小鼠肾脏组织胶原纤维沉积、肾小球基底膜明显增厚,缬沙坦组和芪地糖肾方组这些病理改变均较轻,且芪地糖肾方组更轻,说明缬沙坦和芪地糖肾方均可有效减少ECM沉积,抑制肾小球基底膜增厚。

综上所述,芪地糖肾方有不亚于血管紧张素受体拮抗剂类药物降低DN尿蛋白、抑制肾脏ECM过度沉积及肾小球基底膜增厚的作用,这种作用可能是通过影响血清Klotho蛋白水平及MMP-9/TIMP-1平衡状态实现的。本研究进一步为芪地糖肾方治疗DN提供了理论依据,但中药组方作用靶点、途径复杂,其药理作用机制还有待探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。