基于网络药理学探讨升白方防治化疗后白细胞减少作用机制*

杨 洋 艾 群 胡旭阳 石露露 胡 欣△

人类医疗水平及疾病防控认知尽管已有了极大提升,但恶性肿瘤依旧是世界范围内高发病率和高病死率的重要因素。长期以来,化疗在恶性肿瘤西医的治疗中发挥着核心作用[1]。但化疗在提高癌症患者生存期的同时,带来的不良反应对患者的生理、心理都存在着短暂或长久的影响。其中,由于骨髓对化疗高度敏感,骨髓抑制也就成了化疗中一个不可忽视的问题。化疗后骨髓抑制以白细胞减少最为明显和常见,可导致化疗药物减量、化疗延迟甚至终止,最终影响化疗效果和预后;也可能增加患者感染的风险,而并发感染会导致额外医疗,甚至造成患者死亡。

rhG-CSF类药物的治疗效果较好,但因其使用受限于医保政策,并且药价较昂贵,很大程度上限制了临床应用[2]。该药物维持时间短,并且在化疗过程中,可能导致患者发生发热或骨骼疼痛等不良反应,甚至使骨髓抑制程度加重[3]。面对这些问题,中医药作为中国的特色治疗手段,在防治化疗后白细胞减少方面被证实确临床疗效显著且稳定[4]。胡欣主任倡导零毒抗肿瘤,个体化治疗的理念,在减少肿瘤治疗的不良反应,充分发挥中医药抗肿瘤优势。从而以健脾益肾,补气养血为理论基础,自拟升白经验方:黄芪30 g,党参15 g,茯苓15 g,知母15 g,骨碎补30 g,补骨脂30 g。具有旺生血之源、直补气血的作用,能较好地升高人体白细胞。但该方的药效机制尚不明确,因此借助网络药理学[5], 通过多分子药物协同作用于人体的机制,系统综合地观察升白方防治化疗后白细胞减少这一疾病网络的作用靶点及通路,为临床应用及日后的基础研究奠定了一定的理论来源。

1 资料与方法

1.1 筛选活性成分和预测靶点选用TCMSP平台[6],分别以黄芪、茯苓、党参、知母、骨碎补、补骨脂为关键词进行检索以获取相关化合物信息,筛选条件为OB≥30%、DL≥0.18[7]。并依据已报道的文献,整理出各味中药未检索到的有效成分进行补充。通过Uniprot数据库并利用VLOOKUP函数,将筛选出的靶点转换为对应的基因名。

1.2 构建活性成分-靶点网络依据六味中药及筛选出的相关活性成分和靶点,制作相应的“Network”及“Type”Excel文件,并依次录入Cytoscape 3.7.0软件[8]进行网络的构建,以便于研究活性成分与靶点及其之间的关系。

1.3 白细胞减少症靶点检索Genecards疾病基因数据库[9]中以“Neutropenia”“Leukopenia”“Leucopenia”“Leukocytopenia”为检索关键词进行筛选,将各结果汇总后删去重复靶点,并通过Uniprot对获取的靶点进行标准化转换。

1.4 蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)构建及核心靶点获取在Cytoscape 3.7.0的插件BisoGenet内,先后导入升白方活性成分靶点和白细胞减少症靶点,共生成2个PPI网络,通过提取生成1个交集网络,对该网络进行CytoNCA[10]分析,筛选计算所得到的结果后得到核心靶点。

1.5 通路富集分析将筛选得到的核心靶点输入Metascape平台[11],分别采取GO及KEGG分析,在保存对应结果后,通过Bioinformatics在线网站对结果进行可视化分析。

1.6 分子对接操作选择升白方中活性成分排名的前3个与核心靶点进行分子对接实验,验证2者间的结合潜力。在RCSB[12]数据库中保存靶点蛋白的三维晶体并在TCMSP中下载活性成分化学结构,运用Autodock[13]进行分子对接实验操作。其中的对接分数<-4.25 kcal/mol被认为化合物与目标靶点间有结合活性;<-5.0 kcal/mol表明2者相互作用良好;<-7.0 kcal/mol表示结合活性强烈[14]。

2 结果

2.1 获取升白方活性成分及靶点在TCMSP数据库中,获取升白方89个主要活性成分、207个相应靶点;根据查询到的文献对补骨脂进行补充,获得18个有效成分,174个靶点。将方中六味中药合并后,删除重复以及未找到对应靶点的成分,共筛选得到有效成分70个。汇总靶点并剔除重复项,共获得278个。

2.2 构建活性成分-靶点网络进行升白方活性成分及其对应靶点的关系网络绘制,并对所得的网络图形加以说明,存在节点356个和关系1314条,Degree排名前3位有效成分分别是山奈酚、槲皮素和木犀草素。见图1。

图1 活性成分-靶点网络图

2.3 疾病靶点检索检索Genecards疾病数据库,经筛选、去除重复值后得到疾病相关靶点589个。分别将药物与疾病靶点上传至Excel表格,利用“开始”菜单中的“格式条件”选项获取2列靶点的重复值,从而获知药物与疾病交集靶点为49个。

2.4 PPI构建及核心靶点获取采用Cytoscape软件分别构建药物与疾病的PPI网络,对其构建的结果加以说明:7363个靶点可与升白方中潜在靶点产生间接或直接作用,可达175250种相互关系;有7830个靶点可与白细胞减少症产生间接或者直接的作用,可达185467种相互联系。随后构建二者PPI网络的交集,并计算交集PPI网络拓扑学属性值,分别以“连接度中心性>66”“连接度中心性>136、介度中心性>555.328、紧密度中心性>0.501”为条件,进行2次筛选,共获得209个核心靶点。

2.5 通路富集分析可视化将上述209个核心靶点录入Metascape平台,进行基因富集分析,选择前20条结果进行可视化处理。使用Bioinformatics在线网站将生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)的结果以及KEGG通路的结果绘制成图。见图2、图3。

2.6 分子对接将排名前3的潜在有效成分分别与5个核心靶点MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1进行对接,得到15组配体与受体互作结果(见图4)。研究显示对接分数均小于4.25 kcal·mol,这表明升白方的化合物与目标靶点间均具有结合活性。其中FN1-木犀草素、TP53-木犀草素、TP53-山奈酚对接分值小于7.0 kcal·mol,提示其具有强烈结合能力。分子对接结果为升白方活性成分通过调节核心靶点以防治化疗后白细胞减少提供了证据,也为今后临床用药指导及进一步实验验证的设计提供了数据支持。

图2 GO富集分析通路

图3 KEGG富集分析通路

3 讨论

化疗药物属于大毒之品,其刚猛的药性不仅会耗伤体内气血,还会扰乱阴阳平衡[15]造成五脏功能失调。依据化疗后所表现的症状,属中医学“血虚、虚劳”等病证范畴。“脾为百骸之母,肾为性命之根”,在虚劳的治疗中脾、肾尤为重要,因此防治化疗后白细胞减少也当以调理脾、肾为先。升白方可补气养血、健脾益肾,使受化疗药物所抑制的骨髓精血复生。借助网络药理学的方法,探讨其发挥升白作用的潜在机制,并运用分子对接验证核心靶点与活性成分的作用关系,发现具有良好的活性结合能力,也侧面验证了预测结果有一定可靠性。

排名第一的有效成分是山奈酚,存在于骨碎补、知母和黄芪中。该成分具有多种药理活性,包括抗肿瘤、抗癌活性、抗炎、抗氧化等,目前正被应用于癌症化疗中[16]。该成分既可以诱导细胞凋亡,使细胞周期停滞在G2/M期,从而阻止细胞迁移和侵袭,又可以激活宿主的免疫功能,抑制肿瘤血管生长,增加其他抗癌药物的敏感性[16,17]。槲皮素可以通过调节PI3K/AKT途径来调控依赖EPO的红细胞发育早期阶段。故推测槲皮素在造血过程中发挥了作用,如白细胞的形成[18]。木犀草素在雌激素受体拮抗剂ICI182,780和ER阴性的人乳腺癌细胞株MDA-MB-453存在的情况下,可以减轻阿霉素诱导的细胞毒性[19]。间接对白细胞减少起到了防治的作用。

经筛选获得209个潜在核心靶点,其中较为重要的有MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1。MCM2具有促凋亡作用。MDS骨髓中MCM2比例较高,且与白细胞减少程度相关[20]。TP53是细胞应激反应和造血干细胞稳态的中枢调节因子[21]。而50%的癌症病例携带P53突变,另一半通常存在P53途径缺陷[22],因此通过激活P53阻断IL-1途径,可成功地缓解化疗导致的中性粒细胞减少症[23]。FN是细胞外基质中重要的黏附分子,参与造血细胞的分化和增殖[24]。ESR1是雌激素的受体之一,参与了造血、骨骼以及免疫系统的表达[25]。研究表示,ESR1可调节先天免疫信号通路和免疫细胞的发育[26]。综上所述,升白方通过多靶点对化疗后白细胞减少起到防治作用。

升白方防治化疗后白细胞减少涉及调节细胞对应激的反应、细胞周期过程的调节、调节蛋白质分解代谢过程等多个生物进程。例如 mTORC1整合了细胞内和细胞外主要的信号通路,其中包括细胞应激反应。这种信号整合可以很好地调控合成代谢、分解代谢过程,调节细胞生长和体内平衡[27]。但在癌症中mTORC1介导的信号传导常常发生失调[28]。由此可推测,升白方通过对细胞应激反应的调节有可能通过纠正信号传导,从而促进化疗后白细胞的修复和生成。

从KEGG的结果得知,升白方可能通过干预病毒致癌、癌症中的微核糖核酸、细胞周期、剪接体、HIF-1信号通路等。升白方可能通过干预病毒致癌通路受益于癌细胞的衰老,辅助抗癌,对化疗起到减毒增效的作用。剪接体对前体mRNA成熟和基因表达至关重要[29]。在造血干细胞形成过程中,精心控制的RNA剪接决定了细胞的命运[30]。剪接体的成分耗尽与DNA损伤和细胞周期缺陷的增加有关,而核心剪接体成分的部分消耗导致细胞周期后期阶段的缺陷(G2和有丝分裂),完全耗尽则会导致G1的早期细胞周期停滞[31]。因此,细胞周期停滞可由于剪接体和细胞周期通路的破坏所致。细胞周期涉及许多生命过程,与真核细胞的生长和增殖以及疾病的发生密切相关[32]。故推断可能通过干预上述2条通路,升白方对白细胞中的前体mRNA起到了调控作用。成骨细胞是骨骼造血微环境的重要组成部分,HIF信号通路对造血干细胞(HSC)的维持至关重要,有研究证明了成骨细胞中HIF信号通路传导的分子作用可以靶向地升高局部造血微环境中的HSC[33]。因此,升白方能通过干预HIF信号通路恢复HSC的功能增加白细胞数量。

综上所述,升白方主要通过70个活性成分作用于209个核心靶点,涉及147条关键通路来发挥作用,印证了升白方根据多靶点、多通路防治化疗后白细胞减少的特征。后续将着力设计完善的实验,进一步验证其具体作用机制及靶点。