酮体代谢相关基因ACAT1表达对膀胱癌发生发展的影响

范博皓 曾 源 黄永胜 顾刚利 刘 钊 阎 磊

山东大学齐鲁医院泌尿外科，山东 济南 250012

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系统常见肿瘤之一，近年来其发病率已位居所有恶性肿瘤的前10 位，虽然其死亡率在部分发达国家有所下降，但在大多数国家仍居高不下［1］。BCa的病因及发病机制尚未完全明确，吸烟和高龄是已经证实的高危因素［2］。研究证实，饮食结构可以影响BCa 的生存和进展［3-4］。生酮饮食是指碳水化合物含量非常低、蛋白质含量适中、脂肪含量高的饮食，旨在诱导酮病或酮体的产生。酮体作为生酮饮食的代谢产物，共包含3 种，分别是20%的乙酰乙酸、2%的丙酮和78%的β-羟丁酸。酮体除了可以为机体某些器官（如心脏、大脑、肌肉等）快速提供能量，还可通过改变基因表达、细胞表面受体激活和组蛋白修饰，在代谢性疾病中发挥表观遗传学作用［5］。研究表明，酮体可以抑制结直肠癌、肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力［6-7］，为肿瘤的治疗提供了新的理论指导和方向。

ACAT1编码乙酰辅酶A 乙酰转移酶1（acetyl coenzyme A acetyltransferase 1，ACAT1），在酮体生成的第一步能够可逆性地将乙酰辅酶A 合成为乙酰乙酰辅酶A。ACAT1被发现与阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和肿瘤的发生有关［8］。研究表明，胰岛素可以通过上调ACAT1进而促进结直肠癌的发生、发展［9］。研究表明，ACAT1的聚集可能促进上皮性卵巢癌的进展［10］。然而目前尚缺乏关于ACAT1对于BCa 发生、发展影响的研究。本研究旨在通过对癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）和基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）中BCa 的表达和临床信息数据进行生物信息学分析，评估ACAT1基因在BCa 中的表达和对预后的意义，并进行体外实验，进一步验证ACAT1在膀胱癌进展中的作用。

1 材料和方法

1.1 数据收集和整理

在TCGA 数据库（https：//portal. gdc. cancer.gov/）中下载BCa 表达数据，包含409 个BCa 样本和19个正常样本，应用R软件包“DEseq2”对该数据集进行基因差异表达分析；在GEO 数据库（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）中筛选出GSE199515和GSE13507 2个数据集，对二者进行基因差异表达分析，筛选差异表达基因。3 组差异基因绘制韦恩图，最终筛选出BCa差异表达的基因。

1.2 基因筛选

通过检索PubMed 筛选出酮体代谢相关基因。对目标基因通过Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index. html#/main/step1）进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encylopaedia of genes and genomes，KEGG）富集分析验证。BCa 差异表达基因与酮代谢基因取交集，得到目的基因。

1.3 酮体相关BCa表达差异基因在泛癌中的表达

通过TIMER2.0 数据库（http：//timer. cistrome.org/）对筛选出的酮体代谢相关BCa 表达差异基因在多种癌症中观察其表达差异。

1.4 酮体代谢相关BCa差异基因的生存分析

在HAP数据库中收集ACAT1在BCa中表达的免疫组织化学染色数据，并使用Ualcan数据库绘制不同临床特征下BCa 中ACAT1表达的柱状图，同时通过Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，观察ACAT1表达对BCa生存预后的影响。进一步通过TIMER2.0数据库对BCa表达临床数据进行多因素Cox回归分析，检验ACAT1是否可以独立影响BCa预后。

1.5 免疫细胞浸润相关性分析

通过TIMER2.0数据库分析BCa中ACAT1表达与CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及单核细胞6 种免疫细胞浸润之间的相关性。

1.6 ACAT1低表达模型构建

订购小干扰RNA（SiRNA1 序列为5′-GCUGAAUAUUGCACGAAAUttAUUUCGUGCAAUA UUCAGC-3′；SiRNA2序列为5′-CAGGACGCUUAUG CUAUUAttUAAUAGCAUAAGCGUCCUG-3′），选取生长状态良好的T24 细胞，采用非脂质体阳离子聚合物转染试剂polyfast（MedChemExpress，美国）介导转染。小干扰冻干粉瞬离后用125 µL DEPC-H2O溶解，震荡混匀后瞬离。弃掉旧的培养基，PBS洗涤6孔板中细胞2次，随后加入1 mL无血清培养基，每孔加入3 µL polyfast 试剂和2 µL 小干扰RNA 混合试剂，在37 ℃，5% CO2条件下培养48 h。使用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和Western blot实验验证转染效率。

1.7 ACAT1生物学功能验证

细胞转染siRNA 48 h 后，进行CCK8 实验验证细胞活性和增殖能力；使用克隆形成实验验证细胞的集落形成能力；使用划痕试验验证细胞的迁移能力；使用含有基质胶的Transwell实验验证细胞的侵袭能力。

1.8 统计学处理

使用Wilcoxon 秩和检验和卡方检验对比BCa和正常膀胱组织之间的ACAT1表达差异。预后分析采用Kaplan-Meier 分析、多因素Cox 回归分析。计量资料采用均数 ± 标准差表示，如符合正态分布，两组间比较则采用独立样本t检验，否则采用非参数检验。计数资料采用n（%）表示，组间比较选用χ2检验。图形及组间差异计算使用GraphPad Prism8.0 软件绘制和分析。检验水准α= 0.05。

2 结 果

2.1 酮体代谢相关的BCa差异表达基因筛选

应用R 软件包“edgeR”对TCGA 数据库中下载的BCa表达数据集进行差异分析，得到4 193个差异基因。应用“GEO2R”在线对数据集GSE199515 和GSE13507 进行基因差异分析，分别筛选出1 143 个和996 个差异表达基因，（P< 0.05，logFC > 1）。对3 组差异基因应用在线软件“Venn Diagram”绘制韦恩图，最终筛选出BCa中76个差异表达的基因。通过PubMed 输入关键词“酮体代谢”“酮体”“生酮饮食”等进行检索，筛选出酮体代谢相关基因15个，分别为ACAA1、ACAA2、ACAT1、ACAT2、HADHA、HADHB、ACSS2、HMGCS2、HMGCL、BDH1、OXCT1、GLUT1、TKTL1、SLC16A1、SLC16A7。并对筛选出的基因利用Metascape数据库进行GO和KEGG富集分析，进一步验证筛选出的基因富集在酮体代谢相关通路（图1A）。最后对筛选出的差异表达基因与酮体代谢相关基因取交集得到1个酮体代谢相关的差异表达基因，即ACAT1。

图1 酮体代谢相关膀胱癌差异基因筛选

2.2 ACAT1在BCa中的表达量低于膀胱正常组织

通过TIMER2.0数据库对ACAT1在多种癌症中进行Wilcoxon 秩和检验，发现BCa 组织中ACAT1的表达较正常膀胱组织低，差异具有统计学意义（P<0.001），见图1B。

2.3 ACAT1高表达可能是预后的独立危险因素

HPA数据库的免疫组织化学染色提示，ACAT1在正常组织中的表达高于BCa（图2A）。使用Ualcan数据库分析ACAT1与BCa不同临床性状之间的相关性，发现ACAT1的表达与BCa的性别、年龄、分期及淋巴结转移均呈正相关（P< 0.01），见图2B。通过Kaplan-Meier方法绘制生存曲线显示，高表达ACAT1患者总体生存率低于低表达患者（P< 0.01）。进一步通过TIMER2.0 数据库对BCa 表达临床数据进行多因素COX回归分析提示，高表达ACAT1生存率显著低于低表达患者（P< 0.01），见图2C。

图2 ACAT1对膀胱癌分期和预后的影响

2.4 ACAT1 在BCa 中的表达与免疫细胞浸润大致呈正相关

基于TIMER2.0 数据库分析发现，ACAT1的表达和肿瘤纯度之间呈负相关（r= −0.335，P<0.001）。但ACAT1的表达与部分免疫细胞浸润之间呈正相关，其相关性和差异性为：CD8 + T 细胞（r= 0.242，P< 0.001）、肥大细胞（r= 0.257，P<0.001）、中性粒细胞（r= 0.214，P< 0.001）、巨噬细胞（r= 0.283，P< 0.001）。

2.5 敲减ACAT1促进BCa细胞增殖、迁移和侵袭

qPCR 及Western blot 结果表明，si-ACAT1-1有更高的敲减效率（图3A，B），此序列被用于后续的细胞实验。实验表明，敲减ACAT1能显著提高T24细胞的增殖能力（图3C）和克隆形成能力（图3D）。此外，ACAT1的敲减还能提高T24 细胞的迁移（图3H）和侵袭能力（图3F）。

图3 体外实验验证ACAT1对膀胱癌增殖、迁移和侵袭能力的影响

3 讨 论

在泌尿系统肿瘤中，BCa 发病率仅次于前列腺癌［11］。无痛性血尿是BCa 最常见的临床表现［12-13］。大约75%的BCa 患者发现患病时是非肌层浸润性BCa［14］，而其余25% ～ 30%的患者，BCa 已侵入膀胱壁更深层次，称为肌层浸润性BCa。经尿道膀胱肿瘤切除术是治疗非肌层浸润性BCa 的主要方法，而根治性膀胱切除术一般用于治疗肌层浸润性BCa。为了防止复发，膀胱肿瘤切除术在特定的患者中需要辅以膀胱内灌注［15］。尽管手术方面有了很多改进，围手术期化疗、免疫治疗也得到了广泛应用，但晚期BCa的预后仍然很差。

ACAT 是一种细胞内特有的酶，可以利用游离胆固醇生成胆固醇酯，在维持细胞内胆固醇稳态方面发挥重要作用［16］。在真核生物中，有2 个基因（ACAT1和ACAT2）编码ACAT。ACAT1无处不在，在各种组织和细胞类型中表达，包括肝细胞、肾上腺、神经元、巨噬细胞和肠道的Kupffer 细胞，而ACAT2表达具有较强的特异性，只存在于肠绒毛的顶端，与肠道吸收胆固醇有关［17］。在禁食或饥饿状态下，ACAT1可以催化2分子的乙酰辅酶A形成乙酰乙酰辅酶A进入酮体生成过程［18］。近年来，酮体及其代谢相关酶在肿瘤发生、进展中的作用逐渐受到人们的重视，例如，在肝癌中，3‐羟基丁酸脱氢酶1(3-hydroxybutyrate dehydrogenase 1,BDH1) mRNA 低表达的患者生存率和预后较差［19］。此外，3-琥珀酰辅酶A 转移酶1 (3-oxoacid coenzyme A transferase 1,OXCT1)通过NF-κB 信号通路促进胰腺导管腺癌的吉西他滨耐药［20］。研究表明，过表达ACAT1/2 和OXCT1/2 可以促进乳腺癌细胞增殖［21］。除此之外，ACAT1在前列腺癌组织中的表达较良性前列腺增生组织显著增加［22］。在肾透明细胞癌中，ACAT1的上调与肾透明细胞癌的增殖和侵袭呈负相关［18］。然而，ACAT1在BCa 中是否发挥作用，还未见研究报道。

本研究在TCGA和GEO数据库中筛选出BCa中具有差异表达的基因，与通过文献检索收集到的酮体代谢相关基因取交集得到ACAT1。通过在线数据库分析了ACAT1在BCa 中表达量高于正常膀胱组织，且ACAT1表达与BCa 免疫细胞浸润大致呈正相关，提示ACAT1可能在肿瘤免疫中发挥作用，这也是研究BCa 对免疫治疗敏感性方向的一个潜在切入点。本研究表明，敲低ACAT1可以促进BCa 的增殖、迁移和侵袭，因此认为ACAT1可以抑制BCa的发生和发展。然而，TCGA 数据库中ACAT1高表达的BCa 患者比ACAT1低表达的患者有着更差的预后。对于这种功能和预后结果的不一致性，本研究认为原因可能有以下几点：首先，ACAT1在酮体代谢过程中发挥双向的作用，它既可以促进酮体的生成，也可以加速酮体的利用，其中的机制复杂且尚未完全阐明；其次，ACAT1除了参与酮体代谢途径外，还可以参与胆固醇的代谢、脂肪酸的代谢等多种途径和通路，具体的代谢通路及参与其中的小分子调控物质尚不清楚；再者，TCGA 数据库中ACAT1的表达是基于RNA水平，而基因发挥作用是依赖蛋白水平，各种转录、翻译等阶段的修饰也是导致RNA 和蛋白水平表达不一致的潜在原因。因此，下一步将纳入BCa 临床标本，在蛋白水平检测ACAT1的表达，研究其作为预后指标的潜在意义。并纳入更多的细胞系、动物模型，进一步验证ACAT1在BCa发生进展中的作用及下游调控机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突