类器官研究进展及其在乳腺癌中的应用

李永昊 张 梅

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）研究生部，山东 济南 250117； 2.山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）普通外科学，代谢与消化道肿瘤实验室，腹腔镜技术实验室，山东省医药卫生普外中心重点实验室，山东 济南 250014；3.山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）乳腺外科，山东 济南 250014

乳腺癌是全世界女性中最常见的恶性肿瘤，根据2018 年GLOBOCAN 的统计资料，全世界大约有210 万例乳腺癌患者，每年约63 万人死于这种疾病［1］。乳腺癌是一种表现为肿瘤内或肿瘤间有较大差异性的高度异质性疾病［2-6］。世界卫生组织将乳腺肿瘤区分为20 多种不同的亚型［7］。通常依据雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）的表达和人表皮生长因子受体2 （human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的扩增情况将乳腺癌分为3种亚型［8］。乳腺癌异质性的特征对于新疗法的设计至关重要，目前乳腺癌的治疗正逐步走向成熟，但仍然受到几个因素的制约：第一，肿瘤空间和时间的异质性特征导致来自患者不同区域的病灶具有不同的分子特征，并在肿瘤发生发展过程中产生不同影响［2-3，5，9-10］；第二，肿瘤微环境，包括免疫浸润通过影响癌细胞的行为和分子特征［11-12］，改变癌症进展和转移的潜能；第三，肿瘤的分子特征也可能在特定的癌症治疗方案选择中发生变化［8］。

Dai等［13］从患者样本中提取了多种乳腺癌细胞系，并识别了肿瘤启动和进展的关键信号效应因子。然而，产生这些细胞系的技术方法通常导致亚克隆选择，因此严重低估了乳腺癌的异质性水平。为了解决异质性问题，研究人员在早期从小鼠和人体组织建立的三维模型的基础上，开发出改进的体外模型（如来自患者活检的类器官）［14-15］。目前，患者来源的类器官（patient-derived organoids，PDOs）已在大多数癌症类型中得到发展，这些临床前模型已被证明能够再现其起源组织所表现出的遗传和表型异质性［16-19］。这些临床前模型使人们对乳腺癌的异质性有了更加深入的了解，并使宝贵的人体样本在药物测试中得到更符合临床需要的使用。一般来说，干细胞展现出一种内在的组装成复杂结构的能力。当放置在基质凝胶中，并在适当的外源性因子存在时，干细胞可以被诱导形成包含有组织的细胞簇结构。最近的可用性干细胞派生的类器官系统提供3D 培养的组织模型，提供了一种可作为组织和器官代理的新型生物模型［20］。通过模拟组织发育和稳态的生化和物理线索，从多能干细胞（pluripotent stem cell，PSCs）和成体干细胞（adult stem cell，ASCs）中产生了类器官［20］。类器官概括了大量的生物学参数，包括异质组织特异性细胞的空间组织、细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用，以及类器官中组织特异性细胞产生的某些生理功能。在现有的模型系统中，类器官提供了一种稳定的系统，适合于细胞扩增的培养和操作，同时更能接近体内生理状态［21］。在这种背景下，本文基于类器官模型的研究现状，介绍类器官在肿瘤发病机制、药物筛选、个体化治疗等方面相对于传统二维培养的优势，探索类器官模型在乳腺癌研究中的应用价值，展望类器官的广泛应用前景。

1 类器官的研究进展

1.1 传统模型与3D类器官模型

常用的人类癌症模型包括癌细胞系和人源性肿瘤组织异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDTXs）［22］。癌细胞系源于患者肿瘤组织，对癌症研究作出了巨大贡献。然而，它们也存在明显的不足，例如，从主要患者材料中生成它们的效率非常低，需要对体外2D 培养条件进行广泛地选择和适应。由于只有罕见的克隆能够扩展并能维持多次传代，衍生的细胞系可能经历了实质性的遗传变化，难再重现原始肿瘤的遗传异质性。最近一种叫做“条件重编程”的方法促进了从正常和肿瘤细胞中提取2D 细胞进行高效培养的过程，包括RHO 激酶抑制剂和成纤维细胞喂养细胞的存在［23］。这些培养物可以长期保存，并保持稳定的核型。原发性PDTXs 通过皮下或原位将新鲜提取的源自患者的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内而产生。相比体外培养模型，PDTXs 更具有模仿人类肿瘤生物学特性的优势。由于可以连续将肿瘤组织移植到越来越多的动物体内，可以对癌症治疗的新疗法进行临床前试验。PDTXs 的局限性在于对患者肿瘤亚群的移植效率有限。除此之外，该方案价格昂贵，时间和资料的耗费巨大，而且PDTXs可能经历大量小鼠的特异性肿瘤进化过程［24-25］。

1.2 类器官的发展与应用

Lancaster 在2014 年将“类器官（organoid）”界定为：以人类器官祖细胞或干细胞为原料，通过体外培养能进行细胞分化和谱系定向，自组装为人类器官样结构的一类细胞群［26］。类器官是一种来自干细胞的体外模型，在经过3D培养后，类器官能够包含多种类型的细胞，并能通过增殖和分化，通过类似于它们在体内的行为方式进行自我组织。因此，可以部分程度保留原有器官和组织的结构和功能［27］。类器官技术首先利用了具有丰富上皮结构的器官，如胃［28］、小肠［29-31］、结直肠［30］、胰腺［32］、乳房［33］、和前列腺［34-35］。类器官可根据其起源方式分成3 类［21］，即来自胚胎干细胞的类器官（embryonic stem cells，ESCs）、来自诱导多能干细胞的类器官（induced pluripotent stem cells，IPSCs）和来自成体干细胞的类器官（adult stem cells，ASCs）。类器官的形成过程类似生物体从受精卵发育到成熟的过程，包括精确控制的分化、增殖和凋亡与多细胞自组织和模式配对，最终生成多样化的成熟组织。驱动型干细胞群体经历了类似的培养控制的分化和自组织过程，从而产生组织特异性类器官。在分化失控的情况下（特别是移植后），PSCs将产生畸胎瘤。生物工程策略可用于进一步控制类器官系统的分化和组织，进一步发展成更有代表性的体内组织模型（图1）。

图1 类器官的发展

1.3 类器官的优点

类器官在癌症研究中的主要优势如下：能够保持癌细胞的高度异质性；能够保持癌细胞和微环境基质之间的高接触极性来模拟体内的肿瘤微环境；来源于临床组织的类器官培养效率高、耗时少；肿瘤的类器官模型具备可对肿瘤细胞系执行遗传操作的优点和小鼠人源性肿瘤组织异种移植模型三维复杂体系的特点［36］。因为不同干细胞生物学特征的不同，使得各类型类器官发展前景各异。ESCs类器官能够模仿人体器官生长过程，在形态学特征分析和器官移植技术方面占有一定优势；而IPSCs和ASCs 类器官则在生物精准医疗、难治病建模和新药筛选等领域起到很大的作用［37］（表1）。

表1 类器官的分类及其应用前景

类器官这些特性，使它们能够在体外水平上揭示大多数肿瘤属性，可以用来研究肿瘤干细胞的功能和癌细胞转化机理，准确研究肿瘤细胞的生物特征［38］。

2 类器官在肿瘤中的应用

2.1 类器官在肿瘤发病机制中的应用

慢性炎症在肿瘤发生和治疗耐药中起到促进作用。最常见的炎症性病变有炎症性肠病、肝细胞癌中的乙型或丙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV/ hepatitis C virus，HCV）感染、由幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP）所致的胃炎和Barrett 食管炎。EB 病毒（EB virus，EBV）和人类乳头瘤病毒（hepatitis P virus，HPV）等致癌病毒，不仅编码转化蛋白，而且还能引发炎症。肿瘤细胞和炎症细胞之间的交流包含了适应性、体液性和先天免疫系统的动态成分，以协同调节肿瘤相关的炎症和肿瘤发生。因此，类器官模型可能有助于加强对此类癌症相关炎症的基本认识，为疾病的预防和治疗提供机会［39］。许多与肿瘤相关的感染模型都利用了类器官培养技术，如HBV 和HCV 感染肝类器官［40-43］，HP感染胃类器官［42，44-45］。将HP 微量注射到胃类器官中可引起强烈的炎症反应，例如白介素-8（interleukin-8，IL-8）的释放［42］。上皮细胞与致癌症病原体之间的相互作用表现为胃类器官产生尿素酶，尿素酶是HP的一种化学诱导剂，细菌随后将细菌编码的CagA 转化蛋白传递到胃上皮中［45］。此外，携带致病性聚酮合酶（pathogenic polyketide synthase，pks）的致癌性大肠杆菌长时间暴露于人体肠道类器官会引发致癌性突变［46］。

2.2 类器官在肿瘤微环境中的应用

肿瘤的转化过程和肿瘤微环境中细胞和非细胞成分联系密切，这些成分包含细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts ，CAFs）、内皮细胞以及免疫细胞。因此，构建可以模拟人体内肿瘤细胞、细胞外基质与癌间质细胞之间相互作用的组织培养模型至关重要［47］。研究指出，胰腺星状细胞和胰腺癌类器官共培养形成了典型的胰腺癌间质纤维增生，使得胰腺癌相关成纤维细胞的亚型公诸于世［48］。另一项研究报告了由多能干细胞产生人毛细血管类器官，这种多能干细胞可以自身组装形成毛细血管网，并分为内皮细胞和外膜细胞，并被基底膜包绕。该研究人员把这种成熟类器官移植到小鼠体内之后，建立了一种稳定灌注的血管树，包括大动脉、小动脉和小静脉。人体血管类器官的成功构建，为研究人类肿瘤微环境带来了全新的机会［49］。Cattaneo 等［50］将非小细胞肺癌与外周血淋巴细胞共培养，建立了T细胞免疫治疗的体外试验体系。Dijkstra等［51］则利用结直肠癌类器官与外周血淋巴细胞共培养，成功构建了相同的系统。

2.3 类器官在肿瘤用药筛选中的应用

通过筛选药物，明确药物的疗效及毒性对临床用药指导有着积极意义，药物疗效在一定层面决定了药物的应用广泛程度，而药物毒性决定药物的适用范围。目前对药物作用和细胞毒性的探讨多围绕2D 肿瘤模型展开，忽略了肿瘤的异质性和物种差异，从而影响了药物应用的准确性。肿瘤类器官模型在筛选药物方面有较高的准确性。有研究通过对20 例结直肠癌患者的肿瘤类器官进行药物检测，结果证明肿瘤类器官适合于新药筛选［52］。Pauli等［53］提出，可在药物库中筛查ER+乳腺癌患者源性病例和BRAF 基因突变黑色素瘤患者源性病例，结果表明他莫昔芬、BRAF 基因和MEK 基因抑制剂都是良好的推荐用药，说明高通量筛查有助于确定临床上已证实的靶向用药。Mun 等［54］通过诱导并培养出具备自身更新能力的肝脏类器官模型，成功保存了肝脏的药物代谢与解毒功能，而对于肝毒性药物，该肝脏类器官模型表现出了明确的毒副作用，可进行新药物的肝毒性评价。这些研究成果表明，利用肿瘤类器官可广泛应用于新药筛查，测定基因与药物的相关性，为患者提供个体化的诊疗方法。

2.4 类器官在肿瘤个体化治疗中的应用

个体化治疗又称精准医学，旨在借助基础研究更进一步地了解疾病发生及进展的规律，以便给患者提供个体化、针对性的诊疗方法。类器官在肿瘤个体化治疗的研究中有很大的发展潜力。研究表明，通过检测来自囊性纤维化患者的直肠类器官中囊性纤维化跨膜电导调节器的功能，有助于进一步明确囊性纤维化跨膜电导调节器矫正疗法的适用人群［55］。研究人员对结直肠癌患者类器官的1 977个肿瘤相关基因进行了基因分析，结果表明类器官能够很好地捕获原始肿瘤的遗传特征，为类器官在个性化医疗中的应用提供了有力的证据。Michels等［56］建立了一个CRISPR-Cas9和人结肠类器官的肿瘤抑制因子筛选系统，为高度异质性的结肠恶性肿瘤提供了个性化精准诊疗依据。总体而言，类器官拥有与源肿瘤一样的基因型和表型，与人体内肿瘤的治疗反应高度接近，在肿瘤患者的精准诊疗领域具有巨大潜能。

3 类器官在乳腺癌中的研究前景与应用

3.1 乳腺癌类器官培养模型

从正常乳腺上皮细胞的三维培养模型到建立支持人乳腺原代上皮细胞生长的三维培养体系，后者促进形态复杂和激素敏感的乳腺组织的生长［38］，乳腺类器官的培养经历了逐步发展［14，57-58］过程。2017年，Qu等［53］描述了一种从IPSCs中生成人类乳腺样细胞的方法。人类IPSCs衍生的类乳腺器官可用于建立体外模型，以阐明各种因素对乳腺细胞转化和乳腺癌发育的精确影响，以及个性化的乳腺组织生物工程。研究乳腺癌最常用的模型是细胞系和PDX［59-60］。尽管它们对转化性乳腺癌研究做出了巨大的贡献［61］，但这两种模式系统都有相当大的缺陷。例如肿瘤细胞系在培养过程中出现突变，无法真正模拟癌细胞的原始性状。另外，由于细胞培养技术无法在体内模拟肿瘤细胞和其他基质细胞的相互作用，所以培养的细胞较为单一，也缺少了不同细胞类型的层次［62］。PDX 无法充分表达人类肿瘤的遗传特点和异质性［24，63-64］。类器官培养技术能够保持肿瘤原有的基因型和生物学特征，还具备传代较为稳定、使用较为简便、培养周期短等优势。类器官培育技术对研究肿瘤干细胞向各种类型肿瘤细胞的分化、发现肿瘤细胞异质性、进化与迁移的原因，以及评价药物效果都有重要意义［38］。

3.2 乳腺癌类器官类型及差异

患者源性肿瘤样器官（patient derived tumorlike organ，PDTOS）是体外肿瘤增殖的临床前模型，为进一步深入研究肿瘤发生发展、侵袭过程和药物反应创造了一个很好的实验平台，因为它们反映了原发肿瘤中存在的细胞异质性［65-66］。但是，PDTOS受到缺乏神经系统支配、血管和免疫细胞的影响［67］。

其中1个例子是类器官和乳腺球共培养技术的应用。Vδ2 + T淋巴细胞与来自原代人乳腺上皮细胞的类器官共培养已获得了成功，其中的T 淋巴细胞能够高效地清除三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）细胞。上述发现进一步证实来源于健康献血人员的T淋巴细胞能够被类器官释放和活化，进而用来治疗患者，同时其提供了来源于健康献血人员的T淋巴细胞对患者肿瘤的体外细胞毒性试验的可能性［68］。

3.3 乳腺癌类器官培养中的问题

目前，大部分PDTO标本仍来自手术切除组织。由于活检标本中缺乏干细胞，往往难以建立合格的类器官模型，这使得需要新辅助化疗或姑息性化疗的患者获益很少。多点活检可能是一个解决办法。Sachs 等［16］通过优化乳腺癌类器官培养基，将乳腺癌类器官建立的成功率增加到了80%以上。与先前建立的类器官模型［30］相比，他们强调neuregulin 1的加入促进乳腺癌类器官的有效生成和长期扩展；添加Rho 相关的含有卷曲蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK）抑制剂Y‐27632 有助于改善培养条件；添加Wnt‐3A 并没有显著改善培养条件；高浓度的表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）可以促进增殖，但使乳腺癌类器官逐渐下沉，失去3D组织；高浓度SB202190大大降低了类器官的形成能力。不同批次基质的组成也不相同，这导致了不同批次实验的差异。这突出了一个标准方案的必要性，该方案必须可靠地整合乳腺癌类器官的最佳条件。

4 总结与展望

类器官培养是研究人类发展和人类疾病的一种新手段。它们类似于原始的人体组织，包含正确的细胞类型，并执行某些组织功能。由于它们在体外包含了组织组成、结构和功能的各个方面，为在个性化的人类疾病模型中确定新的治疗策略开辟了可能性。将类器官培养与实时成像的最新进展相结合使我们第一次能够实时地可视化人类发展中的早期事件［69］，它将有可能跟踪细胞和研究，例如，人类皮层板如何从早期的神经祖细胞发展到最终成熟的神经细胞，还可以评估交换单一生长因子对细胞行为的影响。此外，随着新的合成ECM组件的开发，类器官将为确定物理力和细胞形状如何影响组织分化或器官形状提供一个平台。生成类似特定器官的人体3D培养物的可能性为利用类器官作为细胞治疗的来源，以及作为全器官移植的潜在替代方案打开了巨大的可能性［70］。总之，类器官培养结合了活体成像、基因工程和生物材料方面的新进展，在不久的将来，它将影响我们研究人类发展和治疗人类疾病的方式。这些新技术的联合出现，为新疗法的发展和药物发现过程的根本改进带来了希望。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突