青花菜BoWHY2基因克隆及其高温胁迫下的表达特征

裴徐梨,荆赞革,2,施俊宏 ,胡文婷,唐 征,焦 鹏

(1.昆明学院 农学与生命科学学院,云南 昆明 650214;2.温州科技职业学院 农业与生物技术学院,浙江 温州 325006)

0 引言

【研究意义】Whirly(WHY)基因家族是植物特有的一类转录因子,其家族成员可参与植物多种生命进程的调控[1]。首个被鉴定的Whirly家族成员为马铃薯StWHY1,其与诱导应答元件ERE相结合,从而调节抗病基因的表达[2]。青花菜属于十字花科芸薹属植物,营养成分齐全,并含有抗癌物质葡糖异硫氰酸盐,具有特殊的保健作用。因此,研究青花菜WHY基因有助于探讨其在逆境胁迫下的应答机制,对选育适应性广的青花菜新品种意义重大。【前人研究进展】目前,植物WHY基因的研究相对较少,仅在杧果[3]、水稻[4]、辣椒[5]、黄瓜[6]、大豆[7]、番茄[8]和拟南芥[9]等鉴定出WHY基因。WHY基因家族在非生物胁迫和抗病等方面发挥着重要的生物学功能[10]。三明野生蕉WHY基因在8℃条件下表达量变化明显,说明该基因可能在抗寒过程中发挥着重要作用[11];在盐胁迫处理下,天宝蕉WHY基因表现出明显的抗性反应,表明该基因可能在天宝蕉抗盐胁迫过程中发挥着重要作用[12]。此外,SiWHY2转基因型的烟草可通过缓解青枯假单胞菌造成的ROS积累,抵抗病菌的侵染扩散,推测SiWHY2可能通过参与水杨酸依赖的抗病响应途径增强植株的抗病性;茉莉酸甲酯可诱导超表达Whirly2拟南芥叶片更早出现衰老症状,说明在茉莉酸酯处理下,Whirly2对植物叶片的衰老具有调控作用[2]。【研究切入点】青花菜喜冷凉,高温是其生长发育的重要影响因素。虽WHY基因的分子机制在模式植物中研究较多,但其在青花菜高温胁迫下的调控机制仍不清楚。【拟解决的关键问题】通过克隆青花菜BoWHY2基因,分析其序列特征和分子进化,检测其高温胁迫下的表达特征,为进一步研究青花菜BoWHY2在高温胁迫下的应答机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为青花菜高代自交系WN12-95B,由昆明学院青花菜遗传育种课题组选育。常规育苗,五叶期时进行高温胁迫(38℃)处理3 h和12 h,每个处理重复3次。

1.2 方法

1.2.1 青花菜BoWHY2基因的克隆 提取青花菜叶片总RNA,使用Prime Script 1ststrand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第1链。以青花菜转录组数据中的WHY2基因序列为模板,设计特异引物(F：5′-ATGATGAAGCAAGCTCGCACT-3′和R：5′-TTACTCTTTACCCCACTCCAGCTC-3′)进行PCR扩增。PCR扩增程序和体系参照裴徐梨等[13]的方法。

1.2.2 青花菜BoWHY2序列特征分析 利用ProtParam tool、ProtScale和DNAMAN等工具分析BoWHY2的等电点、相对分子量和亲疏水性等序列特征。采用GOR4和SWISS-MODEL预测该蛋白的高级结构[13]。

1.2.3 青花菜BoWHY2同源性和系统进化分析 利用BLAST分析青花菜BoWHY2基因的序列同源性。采用MEGA 5.0构建系统进化树[14]。

1.2.4 青花菜BoWHY2基因的表达特征分析 青花菜BoWHY2基因在高温胁迫下的转录组数据来源于昆明学院青花菜遗传育种课题组前期的高通量测序结果。基因表达量经过标准化处理,用FPKM值表示。

2 结果与分析

2.1 青花菜BoWHY2基因的克隆

由图1可见,青花菜BoWHY2基因PCR扩增获得700 bp左右的条带,经回收纯化后进行TA克隆,测序显示该序列长度为768 bp,包含上下游引物序列(图2),将其命名为BoWHY2。

图1 青花菜BoWHY2基因PCR扩增产物Fig.1 PCR products of broccoli BoWHY2 gene

图2 青花菜BoWHY2基因及其推导的氨基酸序列Fig.2 Broccoli BoWHY2 gene and its deduced amino acid sequence

2.2 青花菜BoWHY2序列特征

青花菜BoWHY2的蛋白分子量为26.2 kD,理论等电点为9.48,属于碱性蛋白。该蛋白脂肪系数为74.42。ProtScale和DNAMAN分析结果显示,其亲水性较差,疏水性较好。二级结构主要由α螺旋(21.67%)、延长线(20.42%)和无规则卷曲(57.92%)组成。三维结构预测显示,该蛋白表面有1个中心空穴并形成带电的内腔。

2.3 青花菜BoWHY2基因序列同源性和进化树

将青花菜BoWHY2基因的核苷酸序列进行NCBI-BLAST比对发现,该基因核苷酸序列与甘蓝(Brassicaoleracea,XM_013734587.1)、油菜(Brassicanapus,XM_013843540.2)、白菜(Brassicarapa,XM_009107547.3)和萝卜(Raphanussativus,XM_018598754.1)的核苷酸同源性分别是100%、97.79%、96.69%和92.76%,核苷酸相似性均在90%以上。与盐芥(Eutremasalsugineum,XM_006390725.2)、亚麻荠(Camelinasativa,XM_010429650.2)、河岸葡萄(Vitisriparia,XM_034818773.1)、荠菜(Capsellarubella),XM_006302697.2)、葡萄(Vitisvinifera,MN395405.1)和醉蝶花(Tarenayahassleriana,XM_010536568.2)的核苷酸同源性分别是82.46%、81.31%、79.63%、79.58%、78.75%和74.61%,核苷酸相似性均在70%以上。

将青花菜BoWHY2核苷酸序列与多个植物构建进化树(图3)。该进化树可分为两大组,第一大组中属十字花科的甘蓝、白菜、油菜、萝卜、盐芥、拟南芥、亚麻芥等聚在同一亚组中,而醉蝶花单独为一亚组。葡萄科的3个物种聚为第二大组。

图3 青花菜BoWHY2系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree of broccoli BoWHY2 gene

2.4 青花菜BoWHY2基因在高温胁迫下的表达特征

由图4可见,高温胁迫处理12 h内,青花菜BoWHY2基因的表达量先下降后上升。高温胁迫下处理3 h时,青花菜BoWHY2基因的表达量逐渐下降至2.15;高温胁迫下处理12 h时,BoWHY2基因的表达量持续上升至4.76,是对照组的1.3倍。

图4 青花菜BoWHY 2基因高温胁迫下的表达特征Fig.4 Expression characteristics of broccoli BoWHY2 gene under high temperature stress

3 讨论

利用PCR技术克隆得到的青花菜BoWHY2基因其序列特征分析结果与前人研究相似[15],表明植物WHY家族的保守型较强,具有类似的生物学功能。通过与其他植物的WHY家族基因进行序列比对发现,青花菜与十字花科植物的亲缘关系较近,和甘蓝、油菜、白菜的同源性均在90%以上。因此,推测Whirly基因的保守性较强,在不同植物中可能有着相似的生物学功能。

非生物胁迫是影响植物生长发育的重要因素。Whirly基因参与了三明野生蕉的抗低温反应,在抗寒过程中发挥着重要的作用。天宝蕉Whirly可被低温处理诱导,推测其参与了抗低温反应,在抗寒相关基因的转录过程中发挥作用[12];王洁如[16]研究表明,Whirly基因表达量随低温处理时间的总体变化趋势与天宝蕉、三明野生蕉的研究结果相似,说明该基因对低温胁迫能够作出积极反应。多个GmWHY的表达量在盐胁迫处理24 h和48 h的叶片中明显上调,表明GmWHY基因可能参与了盐胁迫的调控[7]。研究结果表明,青花菜BoWHY2在高温处理3 h后,基因表达量上调;高温处理12 h后,基因表达量增加,高于对照。说明BoWHY2基因对高温胁迫能够作出正向反应,推测该基因在青花菜抗高温胁迫上有一定的作用。

4 结论

从青花菜克隆的BoWHY2基因长度为768 bp,编码240个氨基酸,该蛋白分子量为26.2 kD,属于碱性蛋白,疏水性较好,理论等电点为9.48。青花菜BoWHY2基因与甘蓝和油菜的进化关系较近,保守性较强,该基因在高温胁迫下其表达量持续升高,对高温胁迫能够作出正向反应。