血管内皮生长因子促后囊膜混浊形成机制研究进展

闫慧超 综述 鲍永珍 审校

北京大学人民医院眼科 北京大学人民医院眼视光中心 北京大学人民医院眼病与视光医学研究所 视网膜脉络膜疾病诊治研究北京市重点实验室 北京大学医学部眼视光学院,北京 100044

后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)是白内障囊外摘除手术及人工晶状体植入术后常见的远期并发症,也是白内障术后继发视力下降的主要原因[1]。据统计,白内障囊外摘除术后1年约10%的患者发生PCO,术后2年增至20%～30%[2-3];成人术后2～5年PCO发生率为30%～50%,儿童发生率近100%[4]。由此可见,PCO增加了临床和社会经济负担。目前对于PCO的发病机制仍未完全阐明,晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)的增生、迁移、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是PCO的主要病理过程[5]。众多细胞因子被证实参与此过程[6];血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可以促进血管内皮细胞生长、增生、迁移;研究发现VEGF广泛参与了眼部结构发育的生理过程及增生性疾病的病理过程,如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、角膜及虹膜新生血管形成、青光眼滤过手术后瘢痕形成等[7-8];近年来,亦有研究表明VEGF在PCO发生和发展中有一定作用[9]。针对VEGF及其受体,研究者开发了相关靶向药物,目前临床上使用的药物包括贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普等[8,10-11]。一系列临床研究表明了这些眼部抗VEGF药物的有效性和安全性[12-15],抗VEGF药物在眼科临床的广泛应用使更多患者受益,药物的适应证也被逐渐拓宽[8]。对于VEGF在PCO中作用的探讨可以为PCO的预防提供新思路,抗VEGF药物的“老药新用”或许能为患者节约成本,减轻临床及社会负担。本文就VEGF在PCO发病机制中的作用研究进展进行综述。

1 VEGF概述

1.1 VEGF的起源

VEGF又称为血管通透因子(vascular permeability factor,VPF)。自1913年Carrel首次描述了组织提取物可以促进体外细胞增生以来,新生血管的生成便成为众多疾病领域的研究热点[16]。随着人们对肿瘤认识的不断加深,科学家们观察到肿瘤的生长大多伴随着血管的增加;1983年,Harold等从豚鼠肿瘤细胞中分离纯化并且鉴定了一种蛋白质,并将其命名为VPF,这种因子可以引起血管通透性增加,诱导血管渗漏,但其对于促进细胞有丝分裂的作用却仍未明确。1989年,Ferrara实验室发现牛垂体滤泡细胞分泌一种可以促进内皮细胞有丝分裂的肝素结合蛋白,并将其命名为VEGF,后称VEGF-A。同年Ferrara等报告了VEGF的cDNA克隆,包括VEGF121、VEGF165、VEGF189。1990年Keck等则描述了VPF的cDNA克隆,其编码肽与VEGF189相同,从而证明了VEGF与VPF是同一种分子[17]。1992年de Vries等发现了内皮细胞上VEGF的高亲和力结合受体Fms样酪氨酸激酶受体(Fms-like tyrosine kinase,FLT),后称VEGF受体1(vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR-1),并发现FLT属于FMS家族,具有酪氨酸激酶活性;后续多项研究先后发现了包括VEGFR-2、VEGFR-3在内的多个VEGF受体及VEGF家族其他成员(VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D)[16-18]。

1.2 VEGF的功能

VEGF家族与不同亚型的VEGFR结合,通过不同信号通路,参与血管生成、胚胎发育、骨骼生长、造血、生殖、淋巴管生成等重要生理过程;也参与炎症、肿瘤等病理过程[19]。现已确定VEGFR-2是信号传导的主要受体,VEGFR-2与VEGF-A结合后导致受体二聚化和自磷酸化,激活了涉及增生、丝状伸展、趋化、EMT等多个下游信号级联反应[20],参与内皮细胞的存活、增生、迁移,促进新生血管的形成及调节血管内皮的通透性等病理生理过程。氧分压在VEGF mRNA表达中起重要作用,低氧环境促进VEGF mRNA表达[19];缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是由α-和β-亚基组成的异二聚体,VEGF是HIF-1α靶作用位点。常氧条件下,存在于细胞质中的脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase,PHD)使HIF-1α中的脯氨酸残基羟化,从而使其通过泛素连接酶复合物降解。在低氧情况下,PHD被抑制,导致HIF-1α被保留,随后可发生核异位;HIF-1α异位结合到各种基因(包括VEGF)的DNA和启动转录的低氧反应原件上,在血管生成,细胞增生、存活、凋亡,红细胞生成,肿瘤及纤维化疾病的EMT等过程中发挥作用[21-23]。

1.3 VEGF与EMT

EMT是诱导细胞运动并促进伤口愈合和胚胎发育存活的过程,是纤维化、慢性炎症、肿瘤转移的关键机制[24]。典型的EMT包括上皮形态的改变,如纺锤形态的获得,上皮标志物(如E-钙黏蛋白)的丢失,α-平滑肌动蛋白、β-连环蛋白的重新定位,间充质标志物(N-钙黏蛋白和波形蛋白)的表达及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活性的增加等[25]。在EMT过程中,排列规整的上皮细胞失去与相邻细胞的附着,伴随细胞形态的改变及运动能力的增加。具有Smad家族蛋白激活能力的转化生长因子β/转化生长因子β受体(transforming growth factor-β/transforming growth factor-β recpetor,TGF-β/TβR)Ⅰ/Ⅱ信号是公认的组织重构和纤维化中EMT的主要诱因[26]。此外,VEGF家族在EMT过程中也起到了重要作用。Yang等[27]发现VEGF在胰腺癌中可促进EMT,增加肿瘤细胞的迁移。VEGFR-1激活导致肿瘤细胞出现类似的EMT反应,包括细胞极性丧失、细胞分离增加等改变。Gonzalez-Moreno等[22]和Mak等[28]研究表明,VEGF可以促进EMT进程,VEGF处理后的细胞表现出梭形形态、E-钙黏蛋白减少、N-钙黏蛋白增加等一系列EMT特征表现。此外,Mak等[28]研究发现,VEGF除了能够促进新生血管形成之外,也能够通过自分泌方式将这些细胞的形态转变为侵袭性增强的成纤维样细胞,从而促进EMT进程。此外,VEGF可以通过影响Smad通路,例如VEGF介导的Smad7下调,进而促进TGF-β在EMT进程中发挥作用[29]。因此,VEGF除了具有促进新生血管生成的作用外,也可以促进非新生血管生成的EMT过程。

2 VEGF在眼组织中的作用

VEGF在眼组织作用中的研究,最初大多集中在视网膜血管的发育及视网膜血管性疾病的病理过程中,如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)等[19,30]。VEGF被证明是视网膜血管发育及缺血/低氧调节的驱动力,视网膜微循环缺血缺氧可导致眼部VEGF水平升高[18]。除视网膜新生血管外,亦有针对脉络膜新生血管、角膜新生血管、虹膜新生血管等的研究[7,31-32];抑制VEGF可以有效抑制上述组织新生血管的形成;反之,上调VEGF水平可以导致这些组织新生血管的生成[30]。以上研究结果表明,VEGF在视网膜之外的眼组织病理性血管生成中也起到重要作用。此外,在干眼、翼状胬肉、青光眼滤过术后瘢痕形成的发病机制中,VEGF也表现出促进炎症反应、细胞增生及纤维化的重要作用[8,33]。目前,抗VEGF药物的主要适应证为年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、RVO、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病变等的治疗[18,34];其也被应用于预防角膜新生血管形成及青光眼滤过手术后瘢痕的形成[32,35]。许多临床研究已证明抗VEGF药物应用于眼部的安全性和有效性,目前抗VEGF药物已在眼科临床治疗中被广泛使用[8,18,36]。

3 VEGF在PCO中的作用机制

晶状体具有基底膜结构,即晶状体囊膜,位于其外表面。白内障摘除术可将位于晶状体囊膜内的大部分LECs去除,但任何剩余细胞可在前囊以及先前无细胞的后囊裸露区增生、迁移,并通过EMT转化为肌成纤维细胞,肌成纤维细胞分泌过多细胞外基质(extracellular matrix,ECM),引起囊袋混浊及皱缩,从而导致 PCO的发生及发展[37]。PCO主要有纤维化和再生2种形式,其中纤维化即从上皮到肌成纤维细胞表型的过度增生、基质收缩、基质沉积和细胞转分化;再生为纤维细胞进一步分化,产生Elschnig珠和Soemmerring环。PCO的纤维化与再生均对视力有不同程度影响。当后囊膜混浊程度较轻时,对视力影响小;当混浊影响视轴区时,视力下降明显[38]。此外,囊袋的收缩、前囊膜纤维化程度等也可对视力造成不同程度影响[1,38]。目前,对PCO的发病机制尚无定论,多种细胞因子被证实参与PCO的病理过程,包括TGF-β、VEGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等[6,9,39-40]。

3.1 晶状体中的VEGF

哺乳动物晶状体在整个生命周期的大部分时间没有血管。而晶状体在发育早期被毛细血管丛包绕,覆盖晶状体前面的血管网源于虹膜基质的脉管系统,晶状体后方的毛细血管网源于玻璃体动脉。在小鼠的胚胎晶状体中可检测到VEGF-A mRNA的表达,这些VEGF-A大多来自于胎儿的晶状体脉管系统,胚胎晚期VEGF-A水平降低,晶状体周围毛细血管网退化。Garcia等[41]认为胚胎期晶状体产生的VEGF-A促进了晶状体的发育,与正常晶状体相比,缺少VEGF-A刺激的晶状体较小。Garcia等[41]将小鼠Vegfa基因靶向敲除后发现,与野生型相比,VegfaCKO小鼠的晶状体在胚胎发育期无法拥有完整的脉管系统,产后晶状体形态较小;且随年龄增长,VegfaCKO小鼠的晶状体可出现不同程度的核混浊。有趣的是,除了房水循环所带来的VEGF外,成年人的LECs及纤维细胞中也检测到了VEGF-A mRNA及VEGFR-2的表达。成年晶状体内VEGF-A的表达可能与晶状体的异常结构有关,晶状体成形后,与其他具有结缔组织的血管不同,其与血管供应分离,并且可能长期处于缺氧环境中[9,41-42]。研究表明,正常情况下成年人晶状体前表面氧分压约为14 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),后表面氧分压为8～10 mmHg,远低于身体其他组织及眼表氧分压[43]。缺氧环境诱导晶状体内部(包括纤维细胞及上皮细胞)产生VEGF-A,并且,前房的低氧环境也可以诱导LECs产生VEGF-A。晶状体含有丰富的糖酵解酶,可以从糖酵解中获得大量ATP;LECs和纤维细胞也含有丰富的葡萄糖转运蛋白,这种代谢机制很可能是由于晶状体的缺氧环境而形成的;同时,这种代谢机制也为促使VEGF-A产生的缺氧环境做了很好的证明。晶状体周围的低氧环境对于其保持透明度和调节生长至关重要。在表面无血管系统的完整晶状体中,VEGF及其受体在晶状体中的功能很可能是互相结合以防止外源性VEGF的侵入对晶状体本身造成更大的伤害[41-43]。

3.2 VEGF直接促进PCO发展

近年来研究发现,VEGF可直接影响PCO的发展进程,Dawes等[44]在对不同年龄组白内障患者术后PCO发生率差异比较的研究中对比了不同年龄组患者的囊袋在离体培养条件下细胞因子水平的差异,结果发现60岁以上患者的囊袋培养中白细胞介素(interleukin,IL)-10、IL-12、IL-13和VEGF在术后2 d即显著升高。Eldred等[9]在探索细胞因子对PCO的作用时对囊袋中27种细胞因子进行了检测,也检测到VEGF水平的升高;在晶状体的囊袋中也检测到了可与VEGF结合的受体(尤其是VEGFR-2的表达)以及供VEGF储存的硫酸乙酰肝素蛋白多糖;特别是VEGF被发现可通过LECs的自分泌机制调节细胞的存活、增生、EMT等过程。VEGFR抑制剂阿昔替尼可抑制体外囊袋系统PCO的进程。此外,TGF、FGF、EGF等其他生长因子及炎性介质,如IL-1α、IL-6等被发现均可上调VEGF mRNA表达[19];白内障术后炎症反应使细胞因子水平升高,各因子之间不断相互作用,提高了VEGF水平,也加速了PCO进程[19,44-45]。

3.3 VEGF与TGF-β2协同参与PCO进程

TGF-β2是PCO过程的起始因子。TGF-β2在体内以激活和无活性2种形式存在,ELISA检测显示人眼房水中总TGF-β2和活性TGF-β2水平为0.491～1.480 ng/ml和0.182～0.283 ng/ml,白内障手术可以使活性TGF-β2水平迅速升高[46];活化后的TGF-β2与细胞膜上TβRⅡ结合,TβRⅡ与配体结合,募集并磷酸化TGFβRⅠ,TGFβRⅠ活化后磷酸化Smad2/Smad3,磷酸化后的Smad2/3与Smad4结合形成Smad4复合体,从而进入细胞核内诱导基因转录,介导LECs的增生、迁移,以及ECM的产生[47];另有研究证明,TGF-β2可通过PI3K途径、MAPK途径、ERK途径、Notch等非经典途径介导这一过程[48-50]。TGF-β2作用通路复杂,因此VEGF可以通过参与其不同作用环节,协同促进PCO发展。

3.3.1TGF-β2通过MMP作用裂解ECM,促使VEGF释放 MMP属于Metzincin蛋白酶家族,通过蛋白水解过程水解蛋白质的肽键,参与众多正常生理过程(如胚胎发育和伤口愈合)及病理过程(如肿瘤形成、纤维化等)[51]。MMP可以降解ECM中的各种蛋白成分,打破组织学屏障,促进细胞迁移[52]。在一项有关MMP对PCO形成影响的离体研究中发现,LECs迁移过程伴随着MMP-2、MMP-9含量的升高,MMP抑制剂可有效降低MMP-2、MMP-9的含量,从而抑制细胞的迁移和囊袋的收缩[53]。此外,MMP被证实在TGF-β2介导的白内障术后LECs迁移和EMT过程中也有重要作用;正常情况下,晶状体中MMP含量很低,白内障术后TGF-β2水平升高导致晶状体内MMP-2、MMP-9激活,表达上调,活化后的MMP能够裂解ECM中的有效成分(晶状体中主要为Ⅳ型胶原蛋白)。ECM被公认存储有大量无活性TGF-β2和VEGF等细胞因子,ECM裂解后,大量细胞因子被释放;VEGF被释放后,可与其受体结合,继续促进LECs的增生、迁移、EMT等过程[9,52]。此外,有研究表明蛋白酶体抑制剂可在体外条件下调节MMP-2、MMP-9活性,从而抑制由TGF-β2介导的细胞基质收缩,减少LECs的增生、迁移、EMT过程[2];外科创伤引起的细胞因子升高一般在术后几个月内恢复正常水平,而PCO是白内障术后远期并发症,短期内细胞因子的升高不足以促进远期PCO的发展,因此LECs需要长期维持活性,不断增生、迁移、发生EMT才可能形成PCO,这有赖于TGF-β2、VEGF及其他细胞因子的自分泌及旁分泌机制[46]。ECM被裂解后的细胞因子或许维持了白内障术后长期细胞因子的水平,这也许可以解释短期炎症反应与PCO之间的关系。

3.3.2TGF-β2通过上调HIF-1α促进VEGF介导的EMT McMahon等[54]在对TGF-β与HIF-1α的关系研究中发现,当用TGF-β刺激肝癌细胞系HepG2和纤维肉瘤细胞系HT1010时,可以促进HIF-1α的核聚集,且刺激时长与HIF-1α表达量在16 h内呈正相关。Basu等[55]在对肾纤维化疾病的研究中发现,TGF-β在常氧或缺氧条件下均可通过Smad途径刺激肾小管上皮细胞中HIF-1α的表达;Nahomi等[21]在对PCO进行研究时发现,采用TGF-β2处理人类LECs后,24 h内HIF-1α上调,并伴有VEGF-A升高。Siegfried等[56]在对白内障术后患者眼部氧含量的研究中发现,白内障手术会使晶状体前后表面氧分压升高。晶状体表面氧分压的升高将会导致HIF-1α降解,但是升高的TGF-β2同时会引起HIF-1α上调,上调后的HIF-α可以通过与VEGF的相互作用,启动VEGF介导的EMT过程[21]。

3.3.3VEGF通过对TGF-β2信号通路中Smad7的抑制作用介导EMT Smad7是Smad蛋白家族中重要的负性调节因子,Smad7可在Smad相关信号传导通路中干扰TGF-β信号;Smad7可与Smad4竞争,抑制Smad复合物的形成,从而影响TGF-β功能的进一步发挥[57]。Saika等[37]首先发现Smad7转基因技术可以抑制小鼠角膜瘢痕化进程,随后发现上调Smad7可以抑制PCO模型小鼠LECs的EMT过程。VEGF可以通过下调Smad7,促进TGF-β在EMT进程中发挥作用。因此VEGF可以通过干扰Smad7对于TGF-β的抑制作用,从而促进TGF-β2介导的EMT过程。

综上所述,VEGF除了在常见眼部病理性新生血管疾病中有重要作用外,在LECs的增生、迁移、EMT等病理过程中也发挥了重要作用;VEGF被证实通过不同信号转导通路和作用机制直接或间接(与TGF-β2的协同作用)促进PCO的形成。目前,抗VEGF药物是唯一广泛应用于眼科增生性病变、针对细胞因子的生物靶向药物,关注和研究VEGF在PCO发生和发展中的作用对PCO的早期预防及临床中白内障术后抗VEGF药物的使用等均有潜在的临床价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突