大叶藻无菌苗快速培育试验

王利芹，刘延岭，崔翠菊，田萍萍，李言

（山东东方海洋科技股份有限公司，山东 烟台 264000）

大叶藻（Zostera marina L.）地方名为海马蔺、海带草、海苫房草，分布于我国河北、山东等省沿海地区，在朝鲜、日本、俄罗斯、欧洲、北美洲等也有分布，通常在沿海潮间带和潮下带较浅的水域形成大片单种群落。大叶藻属于单子叶植物纲（Monocotyledoneae），眼子菜科（Potamo-getonaceae），大叶藻属（Zostera），是一种营沉水生活的海洋高等植物，广泛分布在近海生态系统中，在海洋生态环境保护中起着重要的作用[1]。近几十年来，由于许多人为因素的干扰，海水中悬浮颗粒物质和可溶性营养物质增多，导致大叶藻自然资源衰退，大叶藻植被大量减少，其种群分布范围日益缩小。目前，大叶藻的生物特性、种子萌发等逐渐成为研究热点之一[2]。

由于大叶藻种子在不利环境下具有休眠的特性，休眠时间可长达1 年甚至数年之久[3]。将大叶藻种子采集后直接播种或者播散到海区，由于种子休眠而不能立即进入萌发状态，虽然种子在休眠期间，能够顺利度过不利萌发的环境，但同时也增加被生物吞食的概率。另外由于种子休眠后再萌发时间的不确定性，也使种子萌发不能同步进行，从而造成种子大量损失[4]。若能使休眠的大叶藻种子同步发育，并加速萌发，可以快速地获得大量大叶藻苗。

本试验旨在能够快速高效和低成本地培育大叶藻无菌苗。将种子先进行消毒处理后，利用低盐人工海水和盐度升高驯化，快速打破大叶藻种子的休眠，再用灭菌海水来培养萌发的种子，使种子迅速萌发并且正常发育，实现种子的同步萌发。

1 材料与方法

1.1 材料

大叶藻种子、灭菌海水、蒸馏水、人工海水素、培养皿、吸水纸、镊子、75%乙醇、1.5%的碘化钾（KI），无菌操作台和恒温光照培养箱。

1.2 方法

1.2.1 消毒

（1）选取形状完整、质地坚硬、颗粒饱满、成熟并具有活力的大叶藻种子，用镊子夹住种子，于常温灭菌天然海水中依次涮洗2～3 次，直到没有明显的附着物和杂质，用吸水纸吸干，移至无菌室超净工作台上；

（2）用75%乙醇浸泡10 min，再用灭菌天然海水涮洗2 次，用吸水纸吸干；

（3）将种子移至1.5%的KI 中浸泡20 min，再用灭菌海水涮洗2 次，用吸水纸吸干备用。

1.2.2 低盐度海水配置

采用人工海水素和蒸馏水配制人工海水。在1 000 mL 蒸馏水中加入约5 g 人工海水素，配制成盐度约为0.5%的人工海水（蒸馏水与海水素的质量比例约为200∶1）。具体盐度人工海水的配制方法，可参照下面公式计算求得：

式中：S为盐度值，%；m为1 000 mL 纯水当中需要加入人工海水素的质量，g。向1 000 mL 纯水中加入质量为m的海水素，所得海水盐度即为S%。

1.2.3 光照培养

将上述消毒处理好的种子，接种到盐度为0.5%的灭菌海水中，放入恒温光照培养箱内，在温度15 ℃、湿度60%、光照强度40 μmol/m2·s 条件下（L∶D=12∶12）（L：亮光时长；D：暗光时长）培养。

1.2.4 盐度驯化

分别配制盐度为0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%和3%的人工海水，每天提高盐度0.5%，直至达到3%的自然海水盐度，对萌发的种子进行“盐度升高驯化”；同时开展自然海水盐度对比试验，自然海水的盐度约为3%。

2 结果与分析

正常成熟的种子1～2 周内，可以实现完全萌发，3 周萌发的种子的子叶长度＞1 cm，发育一切正常。种子萌发1 周后，转接到3%的灭菌海水中，在温度15℃、湿度60%、光照强度40 μmol/m2·s 条件下（L∶D=12∶12）培养。1～2 周后萌发的种子的子叶长度可达2～3 cm。盐度0.5%种子试验组萌发状态见图1（a）（b）（c）（d）；盐度3%种子试验组萌发状态见图2（a）（b）。

图1 盐度0.5%种子试验组萌发状态

图2 盐度3%种子试验组萌发状态

挑选合适的种子，经消毒后，接种到盐度0.5%人工海水的培养皿中[图1（a）]，转入恒温光照培养箱内，在温度14℃、光照强度40 μmol/m2·s、光暗周期L∶D=12∶12 条件下，进行种子孵化。3 d后，低盐海水中试验的种子萌发[图1（b）]；经过2 周时间低盐度0.5%试验组大叶藻子叶已长至1 cm 以上[图1（c）]；转移至正常盐度海水，正常海水中又培养一周后的无菌苗[图1（d）]。开展自然海水盐度对比试验，对照组自然海水盐度培养的种子一直未见萌芽迹象，处于休眠状态[图2（a）（b）]。

3 结语

利用低盐度人工海水和盐度升高驯化，打破大叶藻种子的休眠，使种子快速进入萌发生长阶段，低盐促萌发耗时短，效率高。培养过程只需用自然的灭菌海水即可，不需用额外的培养基和生长调节剂，节约成本，操作简便。