鲤疱疹病毒2 型不同分离株的基因组比较分析

周怡，赵路品，刘笑茹，姜有声，2，3

（1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306；2.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；3.上海海洋大学，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306）

1 鲤疱疹病毒2 型

1.1 流行病学

CyHV-2 又称为疱疹病毒性造血器官坏死病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis, HVHNV）、金鱼造血器官坏死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV），与鲤痘疱疹病毒（Carp pox virus，又称鲤疱疹病毒I 型CyHV-1）、锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV，又称鲤疱疹病毒III 型，CyHV-3）同属于疱疹病毒目（Herpesvi rales）、异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）、鲤疱疹病毒属（Cyprini-virus）[1-2]。CyHV-2 的感染性强，致死率高，鱼体感染病毒出现症状后，24～48 h 即死亡。主要临床症状为体表广泛性充血或出血、鳃丝肿胀；解剖发现，患病鱼的鳃和肝胰脏苍白。CyHV-2 引起异育银鲫鳃出血病，主要发生在春秋两季[3-9]。CyHV-2 的传播方式主要为垂直传播和水平传播[10-11]。

1.2 病原学

CyHV-2 是一种线性双链DNA 病毒，其基因组全长约290 kbp，基因组共编码154 个开放阅读框（Open reading frame, ORF），其中有4 个末端重复序列（Terminal repeat, TR）和2 个无编码功能的碎片基因[12]。CyHV-2 的核衣壳呈六角形或球形，直径为115～117 nm，具有皮质层和囊膜的完整病毒颗粒直径为170～220 nm[2，13]。Gao 等[14]利用蔗糖密度梯度，结合超离心纯化病毒粒子，鉴定了CyHV-2 的结构蛋白，通过SDS-PAGE分离病毒蛋白，并用质谱法进行鉴定，结果显示，CyHV-2 含有74 种蛋白，其中包含3 种衣壳蛋白、18 种膜蛋白和8 种主要免疫原性蛋白。文献[7，15]建立异育银鲫脑细胞系（Brain cell lines of Carassius auratus gibelio, GiCB），研究CyHV-2的理化及生物学特性，发现其对酸碱度和有机溶剂敏感。

1.3 患病金鱼、鲫状态比较

CyHV-2 对金鱼和鲫表现出较高的易感性，对金鱼（父本）和鲤（母本）的杂交个体也表现出易感性，但锦鲤不易被感染，杂交个体对CyHV-2 的敏感性低于金鱼和鲫[16]。发病的金鱼和异育银鲫，其生活的水温存在一定差异[17]，金鱼在水温＞25 ℃时，存在感染发病情况。Xu 等[6]试验发现，异育银鲫在水温15～32 ℃的池塘中会暴发疾病，并指出该病暴发的最适温度为20～28 ℃。在水温25 ℃时，CyHV-2 对金鱼和鲫的致死率都很高；＞25 ℃时，其发病状态则存在一定差异，不同的宿主感染后，呈现出不同的病理变化。鲫和异育银鲫患病后，鳃部明显出血，尾鳍末端发白，体表无寄生虫附着，鲫有少量红色腹水，鳔有点状出血，部分异育银鲫体内有浅黄色腹水，鱼鳔上有明显出血性瘀斑，一些患病死亡的异育银鲫，鳃丝因失血而呈苍白色，在鳃盖两侧各形成一个胭脂红色的淤血斑块[8，18-19]。患病金鱼的鳃苍白，脾和肾脏肿胀并呈苍白色，偶尔能见多处白色病灶，肝苍白，肠道空，鳔上有瘀斑性出血，鳍上有水泡状脓疱，有些患病鱼的腹部膨大，眼球突出[8]。

2 CyHV-2 毒株的基因组比较

通过核苷酸序列数据库（GenBank）数据库查找，鲤疱疹病毒2 型共有7 个分离株进行了全基因组测序（表1、2），按照时间顺序，分别为ST-J1、YC-01、SY-C1、1301、SY、YZ-01 和CNDF-TB2015，它们的基因组大小为275 348～290 455 bp。除了CNDF-TB2015 株是环状DNA，其余毒株都是线状DNA。

表1 分离株来源信息

表2 7 株分离株的基因组信息①

李莉娟等[13]研究了从国内患病鲫体内分离的毒株SY-C1 的基因组特征，并与日本株ST-J1 进行了比较基因组学分析，结果表明，2 个毒株序列的同源性为98.8%，在CyHV-2 基因组中唯一区域和末端重复序列的同源性分别为99%和97.6%，说明该2 个毒株的基因组在核苷酸序列水平上高度相似；通过进一步比较发现，SY-C1 的单核苷酸突变、插入、缺失和重排等，与ST-J1 存在明显变异，这2 个毒株的主要差异是SY-C1 基因组在ORF25B 和ORF25C 之间具有一个523 nt 的缺失，这也是2 个毒株基因组最显著的差异。SY-C1 基因组中ORF55编码胸苷激酶（TK）参与核酸代谢，与ST-J1 基因组的不同之处，在于它包含了9 nt 的缺失，此明显差异，也可以用来区别2 个株型。SY-C1 基因组中的3个核心ORF（ORF33、ORF79、ORF107）与ST-J1 基因组中的ORF33、ORF79、ORF107 相同，在其余核心ORF 中两者之间，只有1～3 个氨基酸存在差异[13]。这2 个毒株被分为C 基因型（中国基因型）和J 基因型（日本基因型），国内分离的CyHV-2 毒株更接近C 基因型。

SY 基因组全序列具有154 个ORF 和15 353 bp的TR，总（G+C）含量约为51.6%[20]。生物信息学分析表明，SY 基因组具有10 个ORF 编码膜蛋白，3 个ORF 编码核衣壳蛋白。CaHV（分离株1 301）的片段长度为275 348 bp，包含150 个ORF，（G+C）含量为51.73%，不含TR[21]。CaHV 中的19 个ORF 与SY-C1 中同源物的同源性低于95%，9 个ORF 与ST-J1 中同源物的同源性低于95%。SY、ST-J1 和SY-C13 个毒株之间存在67 个ORF，没有任何变异，这表明CyHV-2 与自身宿主发生了协同进化，宿主的适应性，导致了不同毒株的基因差异。

将ST-J1、SY-C1、SY、CaHV 的序列进行对比，发现ST-J1 和SY-C1 的ORF10 中有2 个富含谷氨酰胺的串联重复序列，而SY 和CaHV 在这串联重复序列之间多了一个含有组氨酸和酪氨酸插入的重复；核心基因ORF107 的串联重复序列DELD 在ST-J1 和SY-C1 中复制2 次，在SY 和CaHV 中复制1 次；PTVTGITQQS 序 列 在ST-J1 和SY-C1 的ORF156 中重复6 次，在SY 中重复3 次。ORF10 和ORF107 可作为SY 和CaHV 的标志，以区别于STJ1 和SY-C1，ORF156 可作为SY 的标志以区别于CaHV。与ST-J1 基因组相比，SY-C1 基因组在ORF25B 和ORF25C 之间存在523 nt 的缺失，在SY和CaHV 基因组中也发现了相同的缺失。ST-J1 基因组串联重复序列在ORF6 和ORF7 之间，有一个87 bp 的DNA 片段，该片段在SY-C1、SY、CaHV 中不存在[20]。此外，ST-J1 在ORF25C 和ORF48 的右侧具有220 bp 的反向重复序列，但在SY-C1、SY 和CaHV 中没有发现该序列。这些发现，表明SY-C1、SY 和CaHV 在进化过程中具有密切关系。

Wang 等[22]运用PhyML 在线构建的系统发育树表明，YZ-01 更接近YC-01，与SY-C1、CNDF-TB2015、1301、YC-01 属于同一组。通过DNAMAN 软件比较YC-01、YZ-01 和CNDF-TB2015 的ORF 发现，除假设蛋白外，三者具有44 个相似的ORF，其中15 个ORF 的相似性达到了100%（例如CNDF-TB2015 的ORF13R、ORF16R、ORF17R 和YC-01、YZ-01 的ORF23、ORF25、ORF25B），17 个ORF 的相似性超过99%。与YC-01 和YZ-01 的ORF80、ORF138 相比，CNDF-TB2015 的ORF86L 和ORF140R 分别具有865 bp（139 829～140 717 个核苷酸）和88 bp（207 246 个核苷酸～207 333 个核苷酸）的片段，这2 个ORF 可作为CNDF-TB2015 的标志以区别于YC-01 和YZ-01。YC-01 的ORF64 和ORF142A 分别有一个39 bp（101 648～101 686 个核苷酸）、42 bp（213 375～213 416 个核苷酸）的片段，该2 个片段在YZ-01 不存在。此外，YZ-01 的ORF25C 比YC-01 的ORF25C，多出一个711 bp 的片段（32 108 ～32 818 个核苷酸）。虽然其余7 个ORF 或多或少存在碱基的缺失、替换，但其相似性也达到了90%。

对Genbank 中7 个CyHV-2 分离株的全基因组分析表明，虽然所有分离株的基因组具有很高的同源性，但是不同的分离株，在其基因组中包含很多突变、插入、缺失和重排。7 个分离株具有134 个相似的ORF，通过DNAMAN 软件进行序列比对发现，24 个ORF 没有发生变化（相似性100%），98 个ORF 比较稳定（相似性≥90%，不包括100%），12 个ORF 突变较多（相似性＜90%），见表3 和4。

表3 7 株分离株之间的同源性① %

表4 7 株分离株相似ORF 的比较①

3 CyHV-2 基因功能

7 个分离株的基因组具有12 个高度保守的ORF（ORF33、ORF46、ORF47、ORF61、ORF71、ORF72、ORF78、ORF79、ORF80、ORF90、ORF92、ORF107），但YZ-01 株的基因组缺少ORF33。这些蛋白都具有编码功能，如ORF33 编码DNA 包装末端酶亚基1，ORF71 编码DNA 解旋酶亚基，ORF72 编码病毒衣壳三联体亚基2，ORF78 编码衣壳成熟蛋白酶，ORF79 编码DNA 聚合酶亚基等[23]。

CyHV-2 ORFs 中只有少数的功能得到确认，如ORF25、ORF25C 和ORF25D 能够编码膜蛋白[24]；ORF104 编码类激酶蛋白，定位于细胞核，与p38 的上游激活子MKK3/MKK6 具有很高的相似性，可以特异性激活p38 MAPK 信号通路，但不能激活JNK 和ERK，而p38 通路的阻断显著提高了感染CyHV-2 银鲫的存活率[25]。金李萍等[26]在异育银鲫脊髓细胞系（Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio, CSC）中，对CyHV-2 ORF57 进行RNA 干扰，结果显示，干扰ORF57 的表达可大幅度降低CyHV-2 的致细胞病变力和复制率，ORF57 在CyHV-2 复制和致细胞病变中起重要作用。

周勇等[27]比较分析了CyHV-2 部分基因的序列差异，包括ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55 和ORF72，结果表明，ORF25 编码蛋白具有较好的免疫原性。鲁建飞[28]将8 条miRNA mimics 转染至GiCF细胞，发现miR-C12 抑制CyHV-2 诱导的GiCF 细胞凋亡，为进一步探讨miR-C12 的调控机制，将miR-C12 mimics、miR-C12 inhibitor、CASP-siRNA-1 转染细胞，结果表明，miR-C12 mimics 和CASPsiRNA-1 均能促进CyHV-2 复制，miR-C12 inhibitor抑制CyHV-2 复制。Wang 等[29]对5 种RING 蛋白（39L、52L、131R、143R）进行了亚细胞定位、泛素化活性等分析，结果表明，RING 结构域外的序列，决定了亚细胞定位和泛素化活性水平，RING 蛋白可能在病毒和宿主的相互作用中具有不同的功能。文献[30]研究表明，某些DNA 病毒可以编码环状RNA（circRNA）来调节病毒感染，circ-udg 是一种来自Cy－HV-2 尿嘧啶DNA 糖基化酶（udg）基因的circRNA，可以促进CyHV-2 复制。CyHV-2 编码17 个miRNA，其中miR-C12 通过靶向半胱天冬酶8，抑制病毒诱导的细胞凋亡并促进病毒复制[31]。

4 结语

目前，CyHV-2 在世界范围内不断的流行并蔓延，严重危害多个国家的水产养殖业。尽管相关研究人员采取了多种方法，由CyHV-2 引起的疾病仍对水产养殖业造成了巨大的经济损失。随着测序技术的进步，现在已有7 个CyHV-2 毒株的全基因组，虽然这7 个基因组具有很高的同源性，但都有其标志性ORF。未来应以CyHV-2 的基因组序列为基础，加强对CyHV-2 的基因功能以及宿主对Cy HV-2 的免疫反应等基础研究，同时加强国际交流合作，以研究出更具体、更有效的预防、控制和治疗方法，遏制病毒的传播扩散。