基于生物信息学方法分析B3GNT7基因在甲状腺癌组织中的表达水平及其对免疫细胞浸润的影响▲

王加中 曹 罡 刘 阳 陈 硕

(西安交通大学第二附属医院普通外科,陕西省西安市 710061)

近年来,甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势[1-2],其发病机制备受关注,其中基因表达差异在甲状腺肿瘤发病中具有重要作用[3]。β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶7(β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 7,B3GNT7)是β-3-N乙酰氨基葡萄糖转移酶家族成员之一,β-3-N乙酰氨基葡萄糖转移酶参与肿瘤免疫应答过程,与多种肿瘤的发生和发展密切相关[4-6]。目前有关B3GNT7基因在甲状腺癌发病机制中的作用研究较少。因此,本文通过生物信息学方法探讨B3GNT7基因在甲状腺癌组织与癌旁组织中的表达差异,并分析其对甲状腺癌组织免疫细胞浸润的影响,为甲状腺癌发病机制的研究提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 B3GNT7在甲状腺癌组织及癌旁组织中的表达情况 在肿瘤免疫评估资源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)的Diff Exp模块中输入B3GNT7基因,检索B3GNT7基因在各类癌组织及其配对的癌旁组织中的表达情况;在GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)中检索并分析B3GNT7基因在甲状腺癌患者癌组织和癌旁组织中的表达情况。

1.2 B3GNT7基因在不同临床特征、病理分期的甲状腺癌患者癌组织中的表达情况 在UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)的TCGA模块中输入B3GNT7基因,分析不同淋巴结转移情况、病理类型、种族的甲状腺癌患者癌组织中B3GNT7基因的表达情况;在GEPIA2数据库的Single Gene Analysis模块中输入B3GNT7基因,分析不同病理分期的甲状腺癌患者癌组织中B3GNT7基因的表达情况。

1.3 B3GNT7基因与甲状腺癌免疫细胞浸润的相关性分析 在TIMER数据库的Survival模块Gene Symbols项目中输入B3GNT7基因,肿瘤类型选择甲状腺癌,临床特征选择年龄、性别、病理类型、肿瘤纯度,免疫细胞选择B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞,采用多因素COX风险回归模型分析B3GNT7基因表达水平对甲状腺癌患者预后的影响;在TIMER数据库Gene模块Gene Symbols项目中输入B3GNT7基因,肿瘤类型选择甲状腺癌,免疫细胞选择B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞,采用Spearman相关性模型分析B3GNT7基因表达水平与免疫细胞浸润丰度的相关性;在TIMER数据库SCNA模块中分析B3GNT7基因拷贝数变异与免疫细胞浸润丰度的关系;在TIMER数据库Correlation模块中分析B3GNT7基因表达水平与免疫细胞标志物、免疫检查点基因、不同类型T淋巴细胞的基因标志物表达水平的相关性。

1.4 统计学分析 采用TIMER、UALCAN、GEPIA2数据库在线数据集提供的统计方法进行分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 B3GNT7基因在多种肿瘤组织及其配对的癌旁组织中的表达水平 TIMER数据库信息显示,相较于配对癌旁组织,B3GNT7基因在胆管癌、甲状腺癌、子宫内膜癌癌组织中呈高表达,在结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌、直肠腺癌、头颈鳞状细胞癌癌组织中呈低表达(均P<0.05),而在膀胱尿路上皮癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、卵巢癌等癌组织中的表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05),见图1。GEPIA2数据库信息显示,甲状腺癌患者癌组织中的B3GNT7基因表达水平高于癌旁组织(P<0.05),见图2。

图1 B3GNT7基因在多种癌组织及其配对的癌旁组织中的表达水平

图2 B3GNT7基因在甲状腺癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平

2.2 B3GNT7基因在不同临床特征、病理分期的甲状腺癌患者癌组织中的表达水平 不同病理分期的甲状腺癌患者癌组织中的B3GNT7基因表达水平比较,差异有统计学意义(P=0.026),不同病理类型、淋巴结转移情况、种族的甲状腺癌患者癌组织中的B3GNT7基因表达水平比较,差异均无统计学意义(P=0.506、0.0805、0.367),见图3。

图3 B3GNT7基因在不同临床特征、病理类型的甲状腺癌患者癌组织中的表达差异

2.3 B3GNT7基因与免疫细胞浸润的相关性分析

2.3.1 B3GNT7基因表达水平、免疫细胞表达水平与甲状腺癌患者预后的关系:多因素COX回归分析结果显示,CD8+T淋巴细胞、B3GNT7基因表达水平是甲状腺癌患者预后的影响因素(均P<0.05),见图4。

图4 免疫细胞表达水平、B3GNT7基因表达水平与甲状腺癌患者预后关系的多因素COX回归分析

2.3.2 B3GNT7基因表达水平与免疫细胞浸润的相关性:Spearman相关性分析结果显示,B3GNT7基因表达水平与B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞浸润丰度有关(均P<0.05),而与肿瘤纯度无明显相关性(P>0.05),见图5。B3GNT7基因拷贝数变异影响B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞的浸润丰度,见图6。

图5 Spearman相关性分析图

图6 B3GNT7基因拷贝数变异对免疫细胞浸润丰度的影响

2.3.3 B3GNT7基因表达水平与免疫细胞标志物和T淋巴细胞标志物表达水平的相关性分析:Spearman相关性分析结果显示,B3GNT7基因表达水平与CD3D、CD3E、CD2、CD8A、CD8B、CD86、集落刺激因子1受体(colony-stimulating factor 1 receptor,CSF1R)、CD68、干扰素调节因子5(interferon regulatory factor 5,IRF5)、前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)、诱导型一氧化氮合酶2(inducible nitric oxide synthase 2,iNOS2)、CD163、V-set和免疫球蛋白结构域4(V-set and immunoglobulin domain containing 4,VSIG4)、癌胚抗原相关细胞附着分子8(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8,CEACAM8)、整联蛋白αM(integrin alpha M,ITGAM)、C-C基序趋化因子受体(C-C motif chemokine receptor,CCR)7、人类白细胞抗原DPB1(human leukocyte antigen DPB1,HLA-DPB1)的表达水平均有关(均P<0.05),见表1。B3GNT7基因表达水平与T淋巴细胞标志物如信号转导因子和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)4、STAT1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、碱性/螺旋-环-螺旋蛋白基因(basic helix-loop-helix,bHLH)E40、CD4、人叉头框蛋白P3(forkhead box P3,FOXP3)、白细胞介素2受体α(interleukin 2 receptor alpha,IL2RA)、 CCR8、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNF receptor superfamily member 9,TNFRSF9)、CCR7、L-选择素(selectin L,SELL)、粒溶酶K(granzyme K,GZMK)、CD69、白细胞介素7受体(interleukin 7 receptor,IL7R)、甲肝病毒细胞受体2(hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)的表达水平均有关(均P<0.05),见表2。

表1 B3GNT7基因表达水平与免疫 细胞标志物表达水平的相关性分析

表2 B3GNT7基因表达水平与T淋巴 细胞标志物表达水平的相关性分析

2.3.4 B3GNT7基因表达水平与免疫检查点基因表达水平的相关性分析:Spearman相关性分析结果显示,B3GNT7基因的表达水平面与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)的表达水平密切相关(P=0.037),与CD274、细胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PDCD1)的表达水平无明显相关性(P=0.418、0.557),见图7。

图7 B3GNT7基因与免疫检查点基因相关性

3 讨 论

近年来,甲状腺癌发病率居高不下,乳头状癌是其主要的病理类型[7],以手术为主的综合治疗对甲状腺乳头状癌的效果较好,但对甲状腺髓样癌、未分化癌的治疗效果欠佳[8]。目前已知多种基因参与甲状腺癌的发生与发展,但其具体机制仍未完全明确,基因表达差异、肿瘤微环境等因素均可能参与甲状腺癌的发病过程[9-11]。肿瘤组织由肿瘤细胞及周围的微环境构成,肿瘤微环境包括各种类型的细胞和细胞外基质,其中免疫细胞是肿瘤微环境中的关键细胞[12]。肿瘤细胞可通过调控基因表达或者分泌细胞免疫抑制因子等机制,影响免疫应答信号通路,发生肿瘤免疫逃逸,使肿瘤微环境中的免疫细胞无法发挥其抗肿瘤作用[13-15]。肿瘤微环境中免疫细胞的浸润程度是肿瘤发病机制研究的热点,各种免疫细胞及基因检测方法的发展使得肿瘤免疫研究进入大数据时代,多个数据库中的基因数据集及生物信息分析软件成为基于生物信息学方法分析肿瘤发生与发展的重要研究手段[16-17]。

B3GNT7是糖基转移酶β-3-N乙酰氨基葡萄糖转移酶家族8个亚族成员之一,定位于19q13.2,由3个外显子和2个内含子组成,其主要功能是催化还原糖蛋白末端N-乙酰半乳糖胺与丝氨酸或苏氨酸形成的α-糖苷键,在人体多种组织中均有表达,有学者发现B3GNT7基因与结直肠癌的发病机制有关[18]。本研究结果显示,B3GNT7基因在胆管癌、甲状腺癌、子宫内膜癌等患者的癌组织中呈高表达,且B3GNT7基因表达与甲状腺癌患者的病理分期密切相关,在甲状腺癌发病机制中可能起重要作用。本研究的COX回归模型分析结果显示,CD8+T淋巴细胞、B3GNT7基因表达水平是甲状腺癌患者预后的影响因素(均P<0.05),相关性分析结果显示B3GNT7基因表达水平与B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞浸润丰度相关,且与多种免疫细胞标志物表达水平密切相关,而且B3GNT7基因拷贝数的变异亦明显影响CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞的浸润丰度,这表明甲状腺癌细胞中B3GNT7基因可能通过某些信号途径影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润,引起肿瘤免疫逃逸。研究表明,B3GNT7蛋白可催化还原细胞表面糖蛋白,通过改变肿瘤细胞表面特异性糖链结构,逃避免疫细胞识别[19],这可能是B3GNT7基因与肿瘤微环境中免疫细胞浸润丰度密切相关的原因。

CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员,通过与抗原呈递细胞上的B7-1结合,向T淋巴细胞传递免疫抑制信号,与桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮等多种自身免疫疾病的发病相关[20-21]。CTLA4的阻断抗体伊匹单抗用于黑色素瘤的治疗已取得较好的效果,是一种潜在的免疫治疗手段[22]。本研究结果显示,B3GNT7基因表达水平与CTLA4表达水平密切相关,而与CD274、PDCD1表达水平无明显相关,这提示CTLA4的阻断抗体具有成为甲状腺癌患者免疫治疗方式的潜在价值,而PD1/PDL1免疫疗法可能对甲状腺癌患者的治疗效果有限。

综上所述,本研究通过生物信息学方法发现B3GNT7基因在甲状腺癌组织中呈高表达,其表达水平与甲状腺癌患者的病理分期密切相关,B3GNT7基因与甲状腺癌组织中B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞的浸润丰度相关,且与CTLA4表达密切相关,但其参与调节免疫细胞浸润的具体机制仍有待进一步探索。