马来沉香组培快繁技术研究

刘德浩 陈智涛 舒夏竺 周小峰 黄竞中 廖文莉

摘要：  以马来沉香半木质化茎段为外植体开展组织培养的研究结果表明，马来沉香适宜的初代培养基为1/2MS+6-   BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L，继代培养基为1/2MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.1mg/L，生根培养基为1/2MS+IBA0.3 mg/L+NAA   2.0 mg/L培养3天后移入1/2MS培养基中继续培养。增值系数为2.5倍，生根率为77.19%。

关键词：  马来沉香；  组织培养；  快繁

中图分类号：   S 722. 3               文献标识码：   A                文章编号：１００1 － 9499（２０23）02 － 0014 － 03

Study on the Rapid Propagation Technology of Aquilaria malaccensis

LIU Dehao CHEN Zhitao SHU Xiazhu ZHOU Xiaofeng HUANG Jingzhong LIAO Wenli

（Huizhou Institute of Forestry，  Guangdong Huizhou 516001）

Abstract The semi-lignified stem segments of Aquilaria malaccensis were used as explants for tissue culture. The explants of stem segments displayed the optimum initial growth on the primary media 1/2MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L， the highest proliferation rate of 2.5 times on subculture 1/2MS+6-BA  0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L， and 77.19% rooting rate on medium1/2MS+IBA0.3 mg/L+NAA2.0 mg/L for 3 days and then transferred to 1/2 MS medium to continue the culture.

Key words Aquilaria malaccensis; tissue culture; rapid propagation

马来沉香（Aquilaria malaccensis）属于瑞香科（Thymelaeaaceae）沉香属（Aquilaria），乔木或小乔木，主要分布于缅甸、泰国、越南、老挝、柬埔寨、马来半岛、苏门答腊等热带、亚热带海拔1 000 m以下的雨林和荒山中[ 1 ， 2 ]，能够适应沙地、石灰质、水分缺乏的坡地及沼泽地[ 3 ， 4 ]。马来沉香全株可入药，且结香率高，沉香香味浓郁，质优价高，经济效益显著[ 5 ， 6 ]。本试验以马来沉香茎段为材料，利用组织培养手段建立植株再生体系，旨在为后期马来沉香的应用、推广提供一定的理论指导和技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料来自马来沉香幼苗，幼苗放入荫棚内栽培60天，根部浇水，试验选用当年生半木质化的嫩枝作为外植体。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 外植体灭菌

连续晴天3天以上，选取生长健壮、无病虫害的马来沉香当年生嫩枝带回实验室预处理。嫩枝去除叶片，流水下冲洗2 h后放入超声波清洗机中，用0.2%灭菌净清洗30 min，无菌水清洗5次备用。

以1%NaCLO和0.1%HgCl2为消毒剂，在不同时间梯度下（3、5、7、9 min）完成灭菌操作。将不同灭菌处理下的马来沉香嫩枝剪成1～2 cm的带芽茎段，接种至MS培养基中，每瓶1个外植体，30次重复[ 7 ]。接种后20天观察污染情况，记录污染数量和启动数量，选出最佳灭菌方式。

1. 2. 2 初代培养

在获得最佳灭菌方法后，以1/2MS作为基础培养基，通过添加不同浓度的6-BA、NAA配制初代培养基。采用双因素四水平正交设计，6-BA分别设定0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L共4个浓度梯度，NAA分别设定0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L共4個浓度梯度，将预处理的马来沉香带芽茎段接种至培养基中，每瓶1个外植体，30次重复。接种后30天观察记录芽的萌动状态，统计启动率[ 8 ， 9 ]，筛选最佳启动配方。

1. 2. 3 继代培养

将初代培养基培养后长出的新芽切下转接到继代培养基中，以1/2MS作为基础培养基。采用双因素四水平正交设计，6-BA分别设定0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4个浓度梯度，NAA分别设定0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L共4个浓度梯度。每个处理10次重复，每瓶接3个单芽。接种30天后观察芽的生长状况，健康芽的生长标准为粗细适中、无愈伤组织、无芽顶尖坏死、无叶片卷曲、无黄叶[ 10 ]，统计增殖倍数。

1. 2. 4 生根培养

切取生长健壮、高度约2 cm的芽苗接种至生根培养基中，生根培养采用单次、二次2种生根培养方法，以MS、1/2MS培养基为基本培养基，单次生根培养的激素浓度分别为NAA（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）、IBA（0、0.1、0.3、0.5 mg/L）；二次生根培养首先是将芽苗接入激素浓度分别为NAA（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）、IBA（0、0.1、0.3、0.5 mg/L）的培养基中培养3天，再接入不添加任何外源激素的1/2MS培养基中培养，每个处理10次重复，每瓶接3个芽苗，接种30天天后统计生根情况。

1. 2. 5 培养条件

初代培养、继代培养和生根培养的培养基均附加蔗糖30 g/L，琼脂粉6 g/L，调节pH值至5.8。培养温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h/d。

1. 2. 6 炼苗与移栽

在完成生根培养后，待幼苗根长达到2 cm以上，将生根瓶苗转移至遮阴70%的大棚内进行炼苗，炼苗步骤为：拧松瓶盖（2 d）、瓶盖拧开少许（3 d）、瓶盖完全打开（5 d）。炼苗10天后将生根苗移栽至装有珍珠岩：泥炭土（1∶1）混合基质的21目穴盘中。基质在使用前先用0.1%的高锰酸钾溶液消毒，移栽过程中洗净培养基，避免根部损伤，移栽后立即浇透水。移栽后每隔10天用1 000倍多菌灵溶液喷洒1次，持续3次。

1. 2. 7 统计分析

观测参数计算方法如下：

（1）污染率=（污染外植体数/接种外植体总数）×100%

（2）启动率=（未污染且成活的外植体/接种外植体总数）×100%

（3）增殖倍数=（统计的芽体总数/接种芽体总数）

（4）生根率=（生根的苗数/接种的苗总数）×100%

（5）成活率=（成活苗数/移栽苗总数）×100%

试验数据先用EXCEL软件进行数据前处理，然后使用SAS21.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 消毒方式与消毒时间选择

由于汞离子能够使蛋白质变性进而杀死外植体表面的微生物，所以总体来看HgCl2处理下的外植体污染率显著低于NaCLO，不同消毒方式及消毒时间存在显著差异（表1）。1/2MS培养基的外植体启动率大于MS培养基外植体启动率。1/2MS做为基本培养基时，在相同HgCl2浓度不同时间处理下的外植体污染率最低的是9 min处理，启动率最高的是5 min处理，随着处理时间的增加，马来沉香的启动率逐渐降低。因此马来沉香茎段外植体适宜消毒方式为0.1% HgCl2浸泡5 min，外植体启动适宜培养基为1/2MS培养基。

2. 2 初代培养

马来沉香茎段外植体灭菌后接种至初代培养基上5～10天腋芽开始萌动，经过一段时间培养后逐步长出新芽。马来沉香茎段外植体在不同浓度6-BA、NAA处理下的差异显著，启动率为26.27%～84.40%，由表2可知，启动率最高的是14号处理，达84.40%。因此，在本次试验中马来沉香茎段的最佳初代培养基为1/2MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L。

2. 3 继代培养

马来沉香茎芽苗在不同浓度6-BA、NAA处理下的差异显著，增殖系数为1.36～2.50，增殖系數最高的是2号处理，即6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L组合，其芽的增殖系数为2.50。因此，马来沉香最佳增殖培养基为1/2MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L。

2. 4 生根培养

由表4可知，马来沉香的生根率偏低，且不同处理间差异显著，单次培养法的生根率为10.32%～   60.13%，且单次培养生根法的生根率普遍低于二次培养生根法，这与土沉香的组培生根情况相似。马来沉香生根率最高的是11号处理，达到77.19%；   其次是12号处理，达到63.34%。因此，在本次试验中马来沉香适宜采用二次培养生根法进行生根培养，其最佳生根培养基为在1/2MS+IBA0.3 mg/L+  NAA2.0 mg/L培养基上培养3天，之后转入1/2MS培养基上继续培养，生根率达到77.19%。

2. 5 炼苗与移栽

马来沉香幼苗经过驯化后移栽至珍珠岩：泥炭土（1∶1）的混合基质中，在荫棚内进行水肥管理。共移栽173株，成活127株，成活率73.41%。

3 结论与讨论

3. 1 试验结果表明，1/2MS作为基础培养基，马来沉香在0.1% HgCl2处理下5 min能够有效灭菌，启动率达到70.49%，污染率降低至17.09%。最优初代培养基为1/2MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L；最优继代培养基为1/2MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，增殖系数达到2.5倍；最优生根培养基为1/2MS+IBA

0.3 mg/L+NAA2.0 mg/L培养3天，转入1/2MS培养基上继续培养，生根率达到77.19%。

3. 2 马来沉香生根数量与根系质量是其幼苗移栽成活率的决定性因素之一，生根培养时间短会导致根系数量少、质量差，随着生根培养时间的增长，马来沉香顶端叶片及顶芽容易产生枯黄现象，生根培养基与培养时间的筛选仍需进一步验证。

3. 3 马来沉香作为重要的药用植物，沉香结香能力是重要的经济指标。有性繁殖难以保证其亲本的遗传特性，通过组织培养手段能够有效降低子代的遗传变异，为获得优良子代提供一种可行的技术手段。通过组织培养技术手段一方面能够最大限度的保留其亲本遗传特性，另一方面又能为开发、利用提供充足的种质资源。

参考文献

［1］ Hasnida H N， Aziah M Y， Salbiah M， et al. Multiplication of   shoots from in vitro germinated seedlings of Eurycoma longifolia and Aquilaria malaccensis.[C]// Tropical Forestry Research in the New Millennium： Meeting Demands & Challenges International Conference on Forestry & Forest Products Research Held in Kuala Lumpar. 2001.

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