基于网络药理学及分子对接技术探讨喘可治注射液治疗咳嗽变异性哮喘的机制

寿璐 何海栋 王婕琼 魏毅 柴秀娟 许先荣*

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是哮喘的一种特殊类型，以慢性、顽固性、刺激性干咳为主要临床表现，吸入冷空气、灰尘、油烟等易诱发或加重咳嗽［1］。国内多中心调查结果显示，CVA 是引发慢性咳嗽的首位病因，因此，对CVA 的早发现、早治疗，改善患者的生活质量是临床工作的重点［2］。目前，西医治疗CVA 主要包括吸入性糖皮质激素、支气管扩张剂、白三烯受体拮抗剂等，虽然使大部分患者临床获益，但停止用药后咳嗽症状又会复发，且长期使用会导致依赖性及毒副作用［3-4］。CVA 病机主要为气道痰气阻滞、肾气亏虚，导致肺气无法宣发肃降，从而引发久咳［5］。喘可治注射液主要有效成分为淫羊藿、巴戟天，具有温补肾阳、止咳平喘、强筋祛风之功效，被广泛应用于CVA 的治疗中并取得良好的临床疗效［6］。网络药理学是基于系统生物学的理论，通过构建“药物-疾病-靶点”网络，进行多靶点药物分子研究，被广泛应用于中药活性化合物发现、作用机制阐释，为中药的复杂体系研究提供新的技术支撑［7］。本研究基于网络药理学对淫羊藿、巴戟天的主要活性成分、作用靶点、基因通路等进行分析，并通过分子对接方法验证活性成分与靶点的结合能力，从而为其治疗CVA 的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 TCMSP 数据库（http：//tcmspw.com），Gene Cards 数据库（https：//www.genecards.org），OMIM 数据库（http：//www.omim.org），UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org），STRING 数据库（https：//cn.string-db.org），Metascape 数据库（https：//metascape.org），PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），PDB 数据库（https：//www.rcsb.org），Venny 2.1.0 在线软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），Cytosape 3.7.2 软件，AutoDock Vina 1.1.2 软件，Chem3D 软件，PYMOL2.3.0软件，GraphPad Prism 9.3.0 软件。

1.2 方法 （1）中药的活性成分及作用靶点的筛选：通过TCMSP 数据库，检索淫羊藿、巴戟天的活性成分，并根据药代动力学ADME 参数，设定口服利用度OB ≥30%且类药性DL ≥0.18 为条件对上述化合物进行筛选，以获取主要的活性成分并导入TCMSP 中，检索与之对应的靶点，同时，应用UniProt 数据库，限定物种为“homo sapiens”，校准靶点的基因信息，得到规范的靶点蛋白基因标识符。（2）“中药-活性成分-药物靶点”网络的构建：应用筛选出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2 上绘制“中药-活性成分-靶基因”网络，运行Network Analyzer 插件进行网络拓扑学参数分析，根据degree 值大小筛选出核心成分。（3）疾病相关靶点的筛选：应用Gene Cards 数据库（Relevance Score ≥1.0）和OMIM 数据库，以“cough variant asthma”作为检索词进行检索，合并去除重复值后，最终获得咳嗽变异性哮喘的靶点。（4）药物-疾病共同靶点的筛选：将喘可治注射液的靶点与咳嗽变异性哮喘的靶点取交集，并利用Venny 2.1.0 在线软件绘制Venn 图，得到“药物-疾病”共同靶基因。（5）PPI 网络的构建：将喘可治注射液与咳嗽变异性哮喘交集后的共同靶点导入STRING 数据库中，限定物种为“homo sapiens”，并以置信度≥0.4 为条件筛选，获取蛋白相互作用关系，并导入Cytosape 3.7.2 中，运行CytoNCA 插件进行拓扑分析，并根据degree 值筛选出核心靶基因。（6）通路和功能富集分析：将喘可治注射液与咳嗽变异性哮喘交集后的共同靶点导入Metascape 平台，将生物种类设定为“homo sapiens”，根据P＜0.01，进行GO 富集分析与KEGG 通路分析，并利用R 语言可视化。（7）分子对接验证：在PubChem 数据库获得核心活性成分的2D结构，导入Chem3D 优化后获得结构能最小的3D 结构，同时应用AutoDock 4.2.6 加氢、分配电荷及设置可旋转柔性键后保存为“pdbqt”文件。在PDB 数据库寻找靶蛋白的3D 结构，采用PYMOL 软件删除水分子及小分子配体后，再应用AutoDock 4.2.6 加氢、分配电荷后保存为“pdbqt”文件。最后，应用AutoDock Vina 1.1.2 将受体蛋白与配体小分子进行分子对接并用PYMOL 进行可视化处理。

2 结果

2.1 中药的活性成分和作用靶点收集 通过检索及设定OB ≥30%且DL ≥0.18 为条件筛选并剔除无相应靶点的活性成分后，共获取38 种活性成分，其中淫羊藿22 种，巴戟天15 种，1 种共活性成分，通过TCMSP 数据库检索活性成分对应的靶点并应用UniProt 数据库校准并去除重复及无效值后共得到229 个靶点。为方便后续研究，按药物的首字母缩写进行编码，其中淫羊藿活性成分被标记为YYH1-YYH22，巴戟天活性成分被标记为BJT1-BJT15，1 种共活性成分被标记为A1。

2.2 “中药-活性成分-药物靶点”网络的构建 通过Cytoscape3.7.2 绘制中药-活性成分-靶点网络，见图1。图中共含有269 个节点（2 个中药节点、38 个活性成分节点、229 个药物作用的靶点节点）和691 条边。通过内置的Network Analyzer 分析该网络拓扑学参数，并根据degree 值大小选取排名前8 的核心成分，见表1。

表1 喘可治注射液的核心活性成分信息

图1 “药物-活性成分-靶点”网络

2.3 咳嗽变异性哮喘靶点的收集与韦恩图的构建 应用Gene Cards 数据库（Relevance Score ≥1.0）和OMIM数据库，以“cough variant asthma”为关键词，检索咳嗽变异性哮喘的靶点，并将两个数据库得到的靶点合并删除重复值后，共得到2,075 个靶点，与喘可治注射液相关的229 个靶点同时导入Venny 2.1.0 在线软件进行交集分析并绘制Venn 图，共获得147 个交集靶点（见图2），即为喘可治注射液治疗咳嗽变异性哮喘的潜在作用靶点。

图2 药物-疾病交集靶点Venn图

2.4 PPI 网络的构建 将147 个交集靶点导入STRING数据库，限定物种“Homo sapiens”，设置置信度≥0.4，剔除1 个无相互作用关系的蛋白后，得到由146 个节点及2,863 条边组成的PPI 网络（见图3）及TSV 格式文件。将TSV 格式文件导入Cytoscape3.7.2 软件中，应用CytoNCA 插件进行拓扑分析，计算出degree 值，根据degree 值大小筛选出排名8 的核心靶点，进行网络构建得到关键靶点PPI 网络图及绘制核心靶点柱状图（见图4～5）。

图3 PPI网络图

图4 核心靶点PPI网络互作图

图5 核心靶点柱状图

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析 （1）GO 功能富集分析：应用Metascape 平台，设置P＜0.01 作为筛选条件，将交集靶点进行GO 的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）分析，总共富集到2,025 个条目，其中1,772 项BP，159 项MF，94 项CC，分别占87.5%、7.9%、4.6%，根据-lgP 值筛选出排名前10 的条目，并用R 语言绘制柱状图（见图6）。（2）KEGG通路富集分析：应用Metascape 平台，设置P＜0.01 作为筛选条件，将交集靶点进行KEGG 分析，共得到191条信号通路，根据-lgP 值筛选出排名前20 条目，并利用R 语言绘气泡图（见图7）。主要涉及P13K-AKT、NF-kappa B、AGE-RAGE 及cAMP 等信号通路，同时，为了进一步探索排名前8 种活性成分及其靶点在疾病通路中发挥的作用，应用Cytoscape 3.7.2 构建“活性成分-靶点-通路”网络（见图8）。

图6 GO功能富集分析

图7 KEGG通路富集分析

图8 活性成分-靶点-通路网络

2.6 分子对接结果 应用AutoDock Vina 1.1.2 对关键靶点和活性成分进行分子对接（见表2 及图9）。结合能值越低，二者的结合效果越好，通常以结合能≤-5.0kJ/mol 作为标准。结果显示，各靶点和活性成分之间对接的最低结合能结果均＜-5.0 kJ/mol，表明活性成分与受体蛋白具有较好的结合活性。分子对接模式图（见图10）。

表2 核心活性成分和核心靶蛋白的结合能（kcal/mol）

图9 关键活性成分-核心靶点分子对接结果-热图

图10 关键活性成分-核心靶点分子对接模式图

3 讨论

本研究通过网络药理学方法筛选出喘可治注射液38 个潜在活性成分，其中山奈酚、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等具有较高的度值，为喘可治注射液发挥作用的关键药效成分。有研究表明，槲皮素可以抑制NLRP3/ASC/Caspase-1 炎症小体的信号通路表达并降低外周血中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的水平［8］。ZHU等［9］研究证实槲皮素通过下调IL-4、IL-5 和miR-155水平从而减轻气道炎症。木犀草素可减少IgE 生成、阻碍STAT3 活化及抑制JAK-STAT 通路达到改善肺部炎症、缓解支气管平滑肌痉挛、减轻气道高反应性的作用［10］。此外，木犀草素通过激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路和抑制Beclin-1-PI3KC3复合物减轻气道重塑从而治疗过敏性哮喘［11］。山奈酚通过抑制Th2 相关炎症细胞因子的释放，抑制肥大细胞（MCs）的活性及IgE 抗体的形成，从而减少过敏性咳嗽的发生［12］。β-谷甾醇通过抑制MCs 释放组胺、减少Th2 细胞因子释放及TNF-α 的表达、阻断诱导型一氧化氮合酶的活性，发挥潜在的抗炎和治疗过敏性哮喘的作用［13］。

PPI 网络分析得出，AKT1、CASP3、IL1B、IL6、VEGFA 等是喘可治注射液治疗咳嗽变异性哮喘的关键靶点，其中，IL6 作为炎症因子，在过敏原诱导下其转导活性增强从而激活成纤维细胞，产生趋化因子，造成肺组织损伤和气道功能障碍［14］。AKT1 作为PI3K-AKT信号通路的关键因子，参与了细胞的生长、代谢、免疫应答，其磷酸化的改变在哮喘的疗效中起重要作用［15］。VEGFA 参与机体嗜酸性炎症、气道重塑以及气道高反应性等多种病理过程，是哮喘发病的关键介质之一［16］。ZHANG 等［17］通过动物实验发现，刺激Caspase-3 的表达，抑制肺组织内TNF-α、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ（IFN-γ）等炎症因子的分泌和诱导炎症细胞凋亡从而减轻哮喘症状。IL1B 是参与先天免疫的重要促炎细胞因子，与哮喘发病的严重程度显著相关［18］。

KEGG 通路分析显示药物作用靶点主要富集于P13K-AKT、NF-kappa B 及cAMP 等信号通路。P13KAKT 信号通路可以调控细胞的生长、增殖、凋亡以及炎症因子的形成，气道凋亡细胞的积累是气道高反应性的重要因素［19］。LI 等［20］研究发现通过上调cAMP-PKACREB 通路可以显著下调IgE、嗜酸性粒细胞浸润及Th2相关炎症细胞因子的释放，从而缓解过敏性哮喘的症状。MA 等［21］发现通过抑制NF-κB 信号通路可以降低IL4、IL5、INF-γ、总IgE 水平，减少杯状细胞增生和支气管壁黏液分泌，从而缓解过敏性哮喘的症状。

综上所述，喘可治注射液中山奈酚、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等潜在活性成分，通过P13K-AKT、NF-kappa B 及cAMP 等关键信号通路，分别与AKT1、CASP3、IL1B、IL6 及VEGFA 等核心靶点以氢键方式结合，减轻气道炎症反应、减少气道重塑及降低气道高反应性，从而发挥治疗咳嗽变异性哮喘的作用。分子对接结果提示关键药效成分与关键靶蛋白均显示较好的结合能力，未来可进行相关动物实验进一步验证本研究的结果，以期为喘可治注射液的进一步开发提供新的理论基础。