新版国家标准《新城疫诊断技术》血凝和血凝抑制试验的理解与操作实践

陈文华,邱 冬 ,吕宗德,黄思彬,李凤玲,陈昌海,*

(1.应节(南京)智能科技有限公司,江苏 南京 210012;2. 江苏省动物疫病预防控制中心;3.南京市动物疫病预防控制中心)

新城疫(Newcastle disease,ND)是严重威胁全球养禽业健康发展的禽病之一,为此世界动物组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病,我国农业农村部将其列为二类动物疫病。血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)是诊断和检测ND最重要的方法之一,也是国际贸易检疫中规定使用的方法,我国对ND实施全面免疫,并要求开展免疫效果评估,也是采用该标准中的HA、HI试验,因而具有广泛的应用。2020年12月14日国家市场监督管理总局和国家标准化管理委员会联合发布了新版《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2020)。

其中对HA和HI试验增加了4HAU抗原配制的标定,对静置时间和结果判定进行了修改。为使广大从业人员更好地理解和掌握新版标准,作者结合本实验实际检测操作实例,就4HAU抗原标定,静置时间及结果判定等几个方面进行分述,以期为准确理解新版标准,提高试验结果准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

鸡新城疫血凝抑制试验抗原 生产日期:2021.05.06,生产批号:10132101,有效期至:2023.05.05;鸡新城疫血凝抑制试验阳性血清 生产日期:2021.06.10,生产批号:10152102,有效期至:2023.06.09;SPF鸡阴性血清 生产日期:2021.04.25,生产批号:10142101,有效期至:2023.04.24,以上均购自青鸟立见诊断技术发展中心。3.8%枸橼酸钠溶液(自配)。0.01mol/L pH 7.2 PBS(自配)。1%鸡红细胞悬液(RBC)(自配)。

1.2 主要仪器

微量移液器;微型摇荡器;96孔V型血凝板。

1.3 鸡血清样品

来自13个养殖场(户)委托检验样品,每场60份,共计780份。

1.4 方法

按照《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2020)所述方法检测。免疫效果评价,按《农业农村部关于印发国家动物疫病监测与流行病学调查计划(2021-2025)的通知》规定,HI效价≥25,判为个体免疫合格。个体免疫抗体合格数量占免疫群体总数不低于70%的,判定为群体免疫合格。

1.4.1 HA试验及4HAU抗原标定 本次测定HA效价为1∶256,配制4HAU抗原液,4HAU抗原标定具体操作如下:

本次所测抗原效价为8log2(1∶256),则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64(256除以4),稀释时,将1 mL抗原加入63 mL PBS中即为4HAU抗原。配制时要根据实际用量,如做标定用,抗原液1～2 mL就够用。(如本次配制抗原液1.2 8mL,取0.02 mL抗原,加入1.26 mLPBS)。

第一步:在96孔V型板第一排第1孔、第2孔、第3孔、第4孔、第5孔、第6孔分别加入25 μL,25 μL*2,25 μL*3,25 μL*4,25 μL*5,25 μL*6 PBS液。

第二步:每孔分别加入4HAU(1∶64倍稀释)25 μL,同时吹打3～5次,充分混匀。

第三步:分别将第一排相应孔中的液体分别取25 μL置第二排相对应的孔中,此时第二排第1～6孔抗原液稀释度依次为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7。

第四步:再在第1～6孔每孔加入25 μLPBS液,第7孔加入50 μLPBS。

第五步:再在每孔加入1%RBC 25 μL。室温静置20～30 min,观察结果。

结果判定同HA试验。本次是第二孔完全凝集(1∶3),则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶48,即将原抗原按1∶48倍稀释为HI试验工作液。

1.4.2 HI试验 将样品、标准阳性血清、阴性血清分别在96孔V型板上倍比稀释,加入标定好的4 HAU抗原后,振荡15 s,室温静置至少20 min。加入1%RBC,振荡混匀后,室温静置20 min～40 min,对照孔呈显著纽扣状时判定结果。

2 结果与分析

2.1 检测结果

13个养殖场个体免疫抗体合格率,群体抗体几何平均滴度(GMT),群体免疫抗体变异系数见表1。由表1可知,13个养殖场个体免疫抗体合格率均达到国家规定70.00%的标准,其中有2个场个体免疫抗体合格率达100.00%,10个场个体免疫抗体合格率均为90.00%以上,说明这些场的新城疫免疫效果优良,有一个场个体免疫抗体合格率为80.00%,经查该场所采样鸡群为初免后28日龄雏鸡,尚未加强免疫。

从13个群体免疫抗体几何平均滴度看,有4个禽场达到9以上,有8个场达到了8以上,表明群体免疫抗体水平非常高,仅个体免疫抗体合格率为80.00%的场,其免疫抗体几何平均滴度为6.09,这再次提示该鸡群要加强免疫。

对同一个场采集的60份样品抗体滴度进行变异系数计算,可以看出,有12个禽群变异系数小于0.3,进一步说明这些群体免疫抗体整齐度非常高,同样个体免疫抗体合格率为80.00%的禽群变异系数为0.89,说明群体免疫抗体整齐度较低,需要加强免疫,提高群体免疫抗体整齐度。

表1 13个鸡场免疫抗体合格率、GMT、CV情况表

2.2 HA试验结果判定时间

新版标准HA试验振荡混匀后室温静置20 min～30 min或2℃～8℃静置60 min,而原版标准是室温20℃～25℃下静置40 min后或4℃静置60 min,相比较我们在实际检测中认为新版标准更准确。

2.3 HAU抗原标定

旧版标准没有关于4HAU抗原标定,过去我们做试验要求做4HAU抗原回滴,将配置好的4HAU抗原做1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等4个稀释度稀释,当稀释度在1:4时定全凝集,认为4HAU抗原配制准确,如果不是1∶4定全凝集,往往凭经验酌情增加或减少抗原量,从而缺乏科学性。新版标准规定了4HAU抗原标定方法,“即将4HAU进行系列稀释,使最终稀释度分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7,然后按照HA试验。如果配制的抗原液为4 HAU,则1∶4稀释度将给出凝集终点,如果4 HAU高于4个单位,可能1∶5或1∶6为终点;如果较低,可能1∶2或1∶3为终点。应根据检测结果将抗原稀释度做适当调整,使工作液确为4 HAU。为便于大家理解,尽管新版国标给出了4 HAU抗原配置和标定方法。但对一些实验室特别是初次接触试验的实验室操作人员来说比较抽象,难以理解。为此笔者所在实验室相关人员对该试验进行了实际操作分析,并对操作过程进行了细化。

2.4 HI试验

新版标准在加入4 HAU抗原后,振荡15 s,室温静置至少20 min或2℃～8℃至少60 min;旧版标准室温下(约20℃～25℃)静置不少于30 min,4℃不少于60 min。新版时间减少了10 min,而且2℃～8℃设定范围比单纯4℃符合实际。旧版中使用的“轻叩”“轻晃”等字样都被新版中“振荡”所代替,符合大规模检测时的实际情况。

2.5 HI结果判定

新版标准给出了血清HI效价为阴性或阳性的判定标准,而旧版标准仅仅是给出了判定是否是新城疫病毒的标准,新版标准更符合实际应用。

3 讨论

HA和HI试验是ND等重要疫病诊断、监测、检测时所使用的最经典方法,也是OIE等推荐国际贸易中所使用的经典方法,具有广泛的使用领域。整个试验过程难度不大,不需要使用高档仪器设备,尤其适用于基层单位及养殖场(户)使用,但由于操作步骤较多,如果操作不规范、不熟练等,最终会影响整体试验结果。

HI试验中,4 HAU抗原配制和标定是该试验能否成立的关键所在,新版标准中增加了对4 HAU抗原进行标定,这提高了抗原配置的精确性,从而确保了最终结果的准确性。本文对新版标准中4 HAU抗原配置和标定进行了细化操作,使得整个操作过程更为简单易懂,便于实验人员理解掌握。

为使HA、HI试验结果判定更清晰,建议在HA结果判定时,在实验桌上放一张白色A4纸,并将血凝板倾斜(小于60°)从正面读结果;HI试验读板时,对准光源,将A4纸放在血凝板上约4～5 cm距离从背面读结果,这样判读结果更清晰。

新版与旧版标准相比,少了新城疫病毒鉴定判定标准。建议改版时,增加“用于检测抗体时,HI效价≤30 log2, 判为HI阴性; HI效价≥4 log2判为HI试验阳性。用于检测抗原(病原)时,抗原液(病毒液)HA效价≥4 log2,且标准新城疫阳性血清对其HI效价≥4 log2,判为新城疫病毒。这样就更能体现HA/HI试验既能用于抗体检测,又能用于抗原(病原)鉴定。

新版标准发布实施,使得新城疫HA、HI试验在操作上更精准详细,在结果判定上更科学准确,体现了标准的引领性、规范性和指导性。它使试验人员更加有标准可依,有步骤可循,提高了试验操作的规范性和精准性,同时也为进一步指导ND防控提供了技术支撑与标准依据。