绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法的特异性试验

豆 玲,周 峰,★,高军军,王雪莹,王志宇,康文彪,*

(1.甘肃省动物疫病预防控制中心,甘肃 兰州 730046;2.英科新创(苏州)生物科技有限公司)

根据快速准确诊断绵羊痘/山羊痘的实际需求,我们成功建立了绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法,为了保证该方法在应用中的准确性和可靠性,我们选用临床症状与绵羊痘/山羊痘相似疫病的病原(口蹄疫病毒、传染性脓疱皮炎病毒)、其他痘病毒(鸡痘病毒)、绵羊痘病毒、羊痘疫苗和羊痘重组质粒样本进行了该RPA检测方法特异性试验研究。

1 材料与方法

1.1 试验样品

1份羊痘疫苗、3份羊痘病毒核酸阳性样本(RPO35基因片段克隆至载体pUC57后制作的重组质粒)、2份口蹄疫病毒核酸阳性样本(疫苗)、2份羊传染性脓疱皮炎病毒核酸阳性样本(疫苗)、2份鸡痘病毒阳性样本(疫苗)、1份阳性对照、2份阴性对照。

1.2 主要试剂和仪器

核酸(DNA/RNA)提取试剂盒购自哈尔滨元亨公司。RPA试剂盒(Twist Basic及Twist nfo)购自英国Twist Dx公司。HybriDetect 1试纸条购自Milenia公司。国产RPA试剂购自先达公司。国产试纸条购自英科新创公司。恒温水浴锅购自Heal force公司。高速离心机购自Eppendorf公司。

1.3 核酸提取

DNA和RNA的提取按照周峰等文献中的方法进行提取,保存。

1.4 RPA扩增

按照表1配制Rehydration Solution溶液。

表1 Rehydration Solution溶液组分

表2 引物序列

在试剂盒准备的8联管中配制Rehydration Solution溶液完成后,总体积为46.5 μL,混匀复溶。将2.5 μL醋酸镁与1 μL模板混合均匀后,加入8联管中,随后将8联管放入水浴锅中,37℃反应15min。反应结束后,取5 μL反应产物至1.5 mL离心管中,用稀释液20倍稀释,混匀后,将试纸条插入离心管中,等待15 min后查看反应结果。反应体系最终镁离子浓度为21 mmol/L。

2 结果

特异性试验结果如图1所示。从图1可以看出,建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法的特异性良好,对羊痘疫苗、羊痘重组质粒、绵羊痘病毒核酸和山羊痘病毒核酸阳性样品能够在试纸条上显示出阳性条带,口蹄疫病毒、传染性脓疱皮炎病毒和鸡痘病毒均无阳性条带出现。

图1 特异性试验结果

3 讨论

绵羊痘/山羊痘是由绵羊痘/山羊痘病毒引起的动物传染病,以绵羊和山羊的体温升高、全身性丘疹或结节、水疱、内脏病变为特征,特别是肺部具有明显的病变特征。其病原绵羊痘病毒/山羊痘病毒的分子生物学检测方法常用的有普通 PCR和荧光定量 PCR,RPA替代PCR检测技术主要优势在于不需要特定昂贵的温控仪器即可快速定量扩增目的DNA或RNA病毒,该方法克服了对传统PCR检测设备的依赖,在临床和现场操作中简单、快捷、实用性强。在成功建立绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法的基础上,本文对改进方法检测的特异性进行了研究,从试验结果看,我们建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法对绵羊痘/山羊痘病毒的检测具有很好的特异性。

4 结论

本研究对我们建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法的特异性开展了试验研究,结果表明,该方法对绵羊痘和山羊痘病毒核酸的检测具有很好的特异性,在绵羊痘/山羊痘病毒的临床检测上应用前景广阔。