河鲀肝油中维生素A、D检测方法研究

黄海枫，夏 鑫*，范奕辉

（1.河北省海洋与水产科学研究院（河北省海洋渔业生态环境监测站），河北秦皇岛 066000；2.河北省海洋生物资源与环境重点实验室，河北秦皇岛 066000；3.国立釜庆大学 水产科学学院食品工学部，釜山 612022）

目前，国际上鱼油的研究在其来源和活性分子、工作原理、分子靶标等19个大项中开展，在多领域结出丰硕成果。BHATT等[1]在顶级医学期刊《新英格兰医学杂志》中指出，正常健康人群服用鱼油制剂有利于预防心血管疾病和糖尿病。河鲀肝油基本性状与海产天然鱼肝油相似，肝油中含有多种维生素、脂肪酸和微量的河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX），除毒去脂的河鲀肝油被证明在缓解癌痛、抑瘤、增强机体免疫力等方面药理作用突出，且无毒性及成瘾性反应[2]。多年来，国内外的研究大部分专注于TTX，对肝油中其他营养成分研究较少。其实河鲀肝油中不但富含多种脂肪酸，也含有维生素A、维生素D等保健性生物成分。在国际国内双循环格局下，食品营养与健康产业正在从较低层次朝高附加值、高技术水平、高加工深度、高规模经济方向演变。高端食品、保健食品、功能食品发展加速，开展富含营养功能因子食品的新型工艺和质量控制技术的研究及集成，研究开发产品质量可控、环境友好的清洁生产工艺是科技发展的必然趋势[3]。因此，如果能够通过新型制备技术提取肝油并高值化利用开发，变废为宝，既能提升资源生物利用率，提高产业附加值，又可减少废弃油脂对环境的污染，具有显著的经济效益与生态效益。而河鲀肝油中的维生素A随季节和生殖情况是有显著变化的，如虫纹东方鲀产卵前每克肝中含维生素A高达4 100国际单位（International Units，IU），产卵后降为960 IU[4]。因此，建立快速可靠、简便易行的鱼肝油质量检测方法，对有效评价河鲀鱼肝油品质优劣、帮助人们合理使用鱼油具有现实参考意义。本实验通过亚临界萃取设备提取河鲀肝油，并采用高效液相色谱法对河鲀肝油中维生素A1和维生素D3成分进行检测研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

河鲀肝脏（唐山海都）；视黄醇（纯度≥95%，阿拉丁）；胆钙化醇（纯度≥99%，麦克林）；甲醇（迪马科技）；无水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、抗坏血酸溶液、氢氧化钾和无水硫酸钠（均为国药集团化学试剂）。

萃取设备（河南省亚临界生物技术有限公司CBE-5L型）；Agilent1200高效液相色谱仪；HH-S型恒温水浴振荡器；旋转蒸发仪（力辰科技RE-2000A型）；KQ-400E超声仪；Milli-Q纯水处理器；JA1003型电子分析天平；H/T12MM型高速离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼肝油制备方法

选取处理好的河鲀肝脏1 kg，放入萃取罐启用真空萃取程序，以丁烷为萃取溶剂，30 ℃萃取30～40 min，重复3～4次，结束脱溶后回收残液增加提取率。用布氏漏斗重复抽滤去脂，澄清液置于旋转蒸发瓶，100 ℃旋蒸至无水分馏出，得到纯净澄清河鲀肝油样品备用。

1.2.2 样品处理

（1）维生素A的提取。准确称取5 g鱼肝油样品，加入20 mL无水乙醇溶解稀释摇匀。加入5 mL 10%抗坏血酸和10 mL氢氧化钾溶液，于沸水浴回流30 min。将皂化液并入分液漏斗，用蒸馏水冲洗回流系统，冲洗液并入分液漏斗中，用50 mL石油醚萃取，合并醚层用蒸馏水洗至中性液，经无水硫酸钠浓缩至干，加入甲醇溶解并定容至10 mL，用0.22 μm滤膜过滤后上机分析。当样品中同时存在几种维生素A形式时，可通过碱水解的方式将其变成单一的视黄醇，以便于测定[5]。

（2）维生素D的提取。准确称取5 g鱼肝油样品，加入50 mL正己烷涡旋混匀，放入高速冷冻离心机，4 ℃下以7 500 r·min-1离心5 min得到上清液。取5 mL上清液，使用0.22 μm滤膜过滤后待分析[6]。

1.2.3 确立色谱条件

（1）维生素A检测条件的确立。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梯度洗脱：0～13 min，甲醇96%，13～20 min，甲醇96%→100%，20～24min，甲醇100%，24～24.5 min，甲醇100%→96%，24.5～30 min，甲醇96%；流速：0.8 mL·min-1；波长：325 nm；进样量：20 µL。

（2）维生素D检测条件的确立。色谱柱：Waters Symmetry R-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；等度洗脱：0～30 min，甲醇96%；流速：1.0 mL·min-1；波长264 nm；进样量：20 µL。

1.2.4 色谱分析方法

本实验采用外标法定量，配制不同浓度的维生素A、维生素D标准系列工作溶液，分别注入高效液相色谱仪中，测定响应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标绘制标准曲线，测定样品中维生素A、维生素D的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

对肝油分离效果产生影响的主要因素包括色谱柱类型、柱容量、流动相流速、流动相组成和比例。本实验主要考察了色谱柱类型、流动相比例、流动相流速对肝油分离效果的影响。

2.1.1 维生素A检测条件的优化

（1）色谱柱的筛选。不同的色谱柱分离效果不同，本实验中使用两种常用色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18、Waters Symmetry R-C18对样品中维生素A、维生素D进行分离，并比较分离效果。将4 µg·mL-1维生素A标准溶液注入高效液相色谱仪，对比两柱的分析效果（图1）。两柱都在10 min内出峰完全。使用Agilent柱时，维生素A的保留时间为7.152 min，峰面积为783.2，对称因子为1.048，峰形较好；使用Waters柱时，维生素A的保留时间为8.591 min，峰面积为175.4，对称因子为1.001，但出现了双峰连在一起的情况。经对比，选择Agilent柱对维生素A进行检测。

图1 使用不同色谱柱检测维生素A效果

（2）流动相比例的优化。使用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，调节流动相中甲醇与水比例为95∶5、96∶4、98∶2，比较不同流动相条件下维生素A的分离效果（图2）。当甲醇∶水=95∶5时，图中出现双峰，基线较不平稳；当甲醇∶水=96∶4时，峰形最佳，出峰时间比较合适。当甲醇∶水=98∶2时，维生素A出峰时间过早且基线不平稳。经对比选择甲醇∶水=96∶4为流动相进行维生素A的检测。

图2 使用不同流动相比例检测维生素A效果

（3）流速的优化。流速是影响目标物峰形的重要因素之一，流速增大目标物的出峰时间会随之提前，峰形变得尖锐，如流速过大，易造成柱压过高，影响峰形美观，也会缩短色谱柱的使用寿命[7]。将1 μg·mL-1的维生素A标准溶液注入高效液相色谱，调整流速为0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1进行分析（图3）。

图3 使用不同流速检测维生素A效果

当流速为0.5 mL·min-1时，维生素A出现双峰难以分离的情况；流速为0.8 mL·min-1时，出峰时间合适，基线较平，峰形较好；流速为1 mL·min-1时，出峰时间较早，且基线不平稳；流速为1.5 mL·min-1时，出峰时间过早，基线不平且柱压过大。经对比选用0.8 mL·min-1的流速进行维生素A的检测。

2.1.2 维生素D检测条件的优化

（1）色谱柱的筛选。将200 μg·mL-1的维生素D标准溶液注入高效液相色谱，使用两个品牌的色谱柱进行分离效果比较（图4）。结果表明，两柱检测维生素D均可在30 min内出峰完全。使用Agilent柱时，维生素D的保留时间为19.555 min，峰面积为9 596.4，对称因子为0.415，峰形外观较差；使用Waters柱时，维生素D的保留时间为20.210 min，峰面积为6 490.6，对称因子为1.097，峰形外观较规整，出峰时间合适，响应更高。经对比选择Waters色谱柱进行维生素D的检测。

图4 使用不同色谱柱检测维生素D效果

（2）流动相比例的优化。以Waters Symmetry R-C18色谱柱作分析柱，设流动相甲醇∶水为95∶5、96∶4、98∶2，测定维生素D（图5）。

图5 使用不同流动相比例检测维生素D效果

当流动相为甲醇∶水=95∶5时，峰形较好，但出峰时间较晚；当流动相为甲醇∶水=96∶4时，出峰时间比较合适，峰形较好，且相邻峰之间影响较小。当流动相比例为甲醇∶水=98∶2时，峰形较差，有双峰相连现象。经对比选择甲醇∶水=96∶4为流动相进行维生素D的检测。

（3）流速的优化。将200 μg·mL-1的维生素D标准溶液注入高效液相色谱，调整流速为0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1进行色谱分析（图6）。当流速为0.5 mL·min-1时，出峰很小且峰形难看；流速为1.0 mL·min-1时，峰形好看，分离情况良好；流速为1.5 mL·min-1时，峰形较好但杂质峰很大并显示柱压过高。经对比选择1.0 mL·min-1的流速进行维生素D检测。

图6 使用不同流速检测维生素D效果

2.2 检测结果

2.2.1 维生素A检测结果

选Agilent Eclipse XDB-C18柱为分析柱，流动相为甲醇∶水（96∶4），流速为0.8 mL·min-1，建立维生素A标准溶液工作曲线，线性回归方程为y=103.478 87x-3.567 22。结果显示维生素A在0.2～6.0 μg·mL-1浓度范围内线性良好，相关系数R2为0.999 5。根据此标准曲线，以同一份样品同天内检测5次，检测结果为0.74 mg/100 g、0.75 mg/100 g、0.76 mg/100 g、0.74 mg/100 g和0.76 mg/100 g，维生素A的平均含量为0.75 mg/100 g，日内精密度（RSD）为1.3%。

2.2.2 维生素D检测结果

选Waters Symmetry R-C18柱分析，流动相甲醇∶水（96∶4），流速1.0 mL·min-1，建立维生素D标准溶液工作曲线，线性回归方程为y=111.998 66x-63.620 36，结果显示维生素D在1～200 μg·mL-1浓度范围内线性良好，相关系数R2为0.998 5。据此标准曲线，以同一份样品同天内检测5次，结果为0.70 mg/100 g、0.68 mg/100 g、0.69 mg/100 g、0.70 mg/100 g和0.68 mg/100 g，维生素D的平均含量为0.69 mg/100 g，日内精密度（RSD）为1%。

3 结论

本实验通过亚临界萃取法制备河鲀肝油，利用HPLC法检测鱼肝油样品中维生素A及维生素D的含量。通过对不同色谱柱、流动相比例、流速大小的分析筛选，优化得到最佳色谱条件，测得样品中维生素A平均含量为0.75 mg/100 g，维生素D平均含量为0.69 mg/100 g。本方法绿色环保，简便易行，能满足对鱼肝油中维生素A及维生素D含量检测的要求，并可为进一步研究此类功能性油脂提供参考。