维生素B12检测方法发展现状研究

王 珏

（安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051）

维生素B12是B族维生素中的一类，其和人们的健康息息相关，通常以辅酶的形式参与人体各种代谢活动，有促进甲基形成、维持巯基还原状态和促进细胞成熟等多种功能。如果人体缺乏维生素B12将会引起神经紊乱、心脏病甚至是癌症等严重疾病，因此维生素B12受到了人们越来越多的关注。但维生素B12在人体内的含量很少，体外稳定性较差，化合物组成复杂，对其进行分析存在相当的难度。因此，选择精准且高效的维生素B12检测方法也就显得极为重要。

1 维生素B12性状及功能

维生素B12（Vitamin B12），又名钴胺素，是一种含钴的咕啉类化合物的总称，同时其也是人体内唯一一种含有金属元素的水溶性维生素，由Elders等人于1926年在使用肝浸膏治疗恶性贫血症时首次发现。维生素B12为红色结晶体，其熔点较高（＞320 ℃），没有特殊气味，且易溶于水、乙醇、甲醇等溶液，但不溶于乙醚、丙酮等溶液。维生素B12溶于水后的水溶液呈现中性，且性状表现稳定，但在处于强酸（pH＜2）或者强碱（pH＞9）的环境中易分解。

维生素B12是一种结构较为复杂的小分子，其化学分子式为CoC63H88O14N14P，相对分子质量为1 355.38，呈类八面体结构。一般来讲，动植物自身不具有合成维生素B12的能力，因此人类摄入的绝大部分维生素B12来源于肉类和海产品，而小部分的发酵食品也会含有少量的维生素B12。在自然界中，能够生成维生素B12的主要是放线菌、细菌、米根霉菌等微生物。对于动物来讲，由于其肠道内所共生的细菌种类较多，其中诸如干酪乳杆菌等具有合成维生素B12的能力，因此在这些细菌的作用下，动物也能够产生不同水平的维生素B12，以维持身体正常的代谢活动。

2 维生素B12检测方法

2.1 液相色谱-质谱法

液相色谱质谱法作为一种新兴的分析检测方法，它的出现为食品分析检测技术提供了更为多元化的选择。液相色谱-质谱分析法将液相色谱所拥有的高效迅速以及质谱所拥有的高灵敏度、强定性力等优点有效结合起来，可以对多种不同的样品开展定性以及定量化分析。施煜等[1]采用液相色谱-质谱法对运动饮料中维生素B12等维生素进行了测量，样品用水进行超声提取之后，采用ACQUITY HSS T3液相色谱柱分离，以浓度为0.1%的甲酸甲醇混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，相关系数＞0.999，回收率为90%～102.3%，实验结果表明该方法适用于对运动饮料中所含维生素含量进行测定。顾文等[2]采用UPLC-MS法对固体饮料中的维生素B12含量进行测定，以醋酸为提取液，采用Strata C18固相萃取柱净化并富集维生素B12，经过洗脱定容之后再采用Agilent ZORBAXSB-Aq C18高效色谱柱分离，进行定量检测，研究结果表明采用该方法对维生素B12进行检测具有较高的精准度和重现性。

2.2 微生物法

微生物法也是一种常见的维生素测定方法，主要利用维生素的特异性，在特定环境下对微生物进行培养，并利用微生物的新陈代谢来对维生素进行测定。宴涛等[3]采用微生物法对功能性饮料中的维生素B12含量进行了研究，利用莱士曼氏乳酸杆菌生长速率与B12浓度的线性关系，制备标准曲线，根据标准曲线计算样品中B12的含量，相关系数为0.993，在0～0.1 ng，吸光度值与维生素B12含量呈现出良好的线性关系。韩冀等[4]采用微生物法对宠物食品中的维生素B12进行了测定，将均质样品加入50 mL无菌离心管中，然后加入40 mL去离子水，在95 ℃水浴中提取30 min，快速冷却之后，用0.22 μm无菌滤膜过滤取滤液，经过处理后采用微生物法进行检测，回收率为94.0%～106.0%；试验结果表明，采用微生物法对宠物食品中维生素B12含量进行测定具有灵敏度高、精准度较高的优点。

2.3 分光光度法

采用分光光度法检测维生素B12主要是利用维生素B12具有水溶性的特点，对紫外线有较强的吸收作用。采用分光光度法测定维生素B12具有灵敏度较高、操作简便以及使用成本较低的优点。汤家华等[5]采用分光光度法对维生素B12中钴的含量进行了测定，将一定量的样品溶液转移至10 mL容量瓶中，再依次向其中加入pH值为9.2的缓冲溶液2.0 mL、50 g·L-1TritonX-100 2.0 mL、0.4 g·L-15’-硝基水杨基荧光酮溶液1.0 mL，用超纯水定容至刻度后，摇匀，然后在波长为546 nm处检测试样的吸光度。研究结果表明，表观摩尔吸光系数为3.7×104L·mol-1·cm-1，RSD为2.2%，回收率为96%，满足分析要求。

2.4 高效液相色谱法

高效液相色谱法作为当今一种重要的技术平台，其具有高灵敏度、高分辨率以及高通量等优点，使其成为检测维生素B12时常用的一种方法。高效液相色谱法通常会采用C18色谱柱，用流动相进行洗脱完成对维生素B12的分离，因此该方法适用于对血液或者药品中维生素B12进行检测。为有效降低高效液相色谱法检测维生素B12的检出限，研究人员开发出了多种新型的前处理方法，提升了检测的精准度。

随着科学技术的不断发展，液相色谱法被不断优化和改进，并被广泛应用在了各种化合物的检测中。何文等[6]采用高效液相色谱法对婴幼儿乳粉中维生素B12含量进行了测定，乳粉样品经过水溶解后，经免疫亲和柱净化，进行超声提取、高速离心之后过滤，然后上机进行检测，采用流动相为甲醇溶液，色谱柱温度为40 ℃，检测波长为361 nm，采用外标法对维生素B12开展了定量分析。贺习文等[7]则采用磷酸盐和甲醇的混合液作为流动相，检测波长设定为361 nm，对饲料中含有的维生素B12进行了检测。检测结果显示，该方法具有良好的线性，相关系数为0.999 9，检出限为0.05 μg·mL-1，具有较高的检测准确度。

2.5 原子吸收光谱法

原子吸收光谱法也是一种十分重要的维生素B12检测方法，其主要是利用维生素B12中所含有的配位金属原色钴，对钴含量进行测定，进行相应的换算即可得出维生素B12的含量。用该方法来检测维生素B12具有检出限较低、灵敏度较高、重复性较强等诸多优点，因此被广泛应用于各种保健品以及婴幼儿乳品中维生素B12含量的检测。毕雪艳[8]采用火焰原子吸收法对维生素B12中钴的含量进行了测定，检测波长设定为240.7 nm，乙炔流量为2.0 L·min-1。检测结果表明，钴浓度在一定范围内具有良好的线性关系，回收率为98.8%，该方法测定维生素B12钴含量具有灵敏度高、结果精准等优点。

2.6 毛细管电泳法

毛细管电泳法的应用始于1980年代末期，是一种以高压电场作为驱动力，以毛细管作为分离通道，结合样品中各个组分之间淌度和分配行为上的不同来实现分离的一种液相方法。毛细管电泳法具有快速高效的优点，因此被广泛应用于水溶性维生素的检测。

2.7 化学发光法

从分类上来看，化学发光法属于分子发光光谱分析法的一种，其主要是利用化学检测体系中被测样品浓度与体系的化学发光强度在一定范围内呈线性关系的原理，使用专业的仪器来对体系化学发光强度进行检测，进而对被测样品进行分析。因此，采用化学发光法检测食品中维生素B12是以某些特定试剂能够与维生素B12产生反应发光为基础的。朱金坤等[9]建立了一种新型毛细管电泳-化学发光法检测维生素B12，线性范围为6×10-7～6×10-4mol·L-1，RSD为2.4%，回收率为97%～106%。实验结果表明，采用该方法对维生素B12进行检测可以得出更为精准、可靠的检测数据。

2.8 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法是一种在免疫酶技术基础上研发出的新型免疫测定技术，由瑞典学者Engvall等人于1971年首次提出，其主要原理是通过抗体和酶复合物结合，通过显色反应来对样本进行检测。李江等[10]采用酶联免疫吸附法对婴幼儿配方奶粉中维生素B12含量进行了检测，采用60%的甲醇溶液来提取奶粉样本，采用酶联免疫吸附检测试剂盒标板来包被有维生素B12的抗原，并让其保持免疫活性，然后加入酶反应底物，根据颜色变化的深浅来对维生素B12进行定量分析。实验结果表明，采用该方法测定维生素B12的相关系数为99.7%，检出限在3～243 μg·kg-1，具有较高的灵敏性和精准度，且操作方法较为简单。

3 试剂盒法与国标法测定维生素B12的比较

鉴于维生素B12具有不稳定性，在对样本进行采集、转移和存储过程中要特别注意环境温度和光照环境，并依据具体的保存条件在规定时间内对样本进行检测，以确保检测结果的准确性。当前针对维生素B12含量进行检测的方法多种多样，而在实际应用过程中较为常见的两种方法为国标法和试剂盒法。余文[11]采用试剂盒法对婴幼儿乳粉以及功能饮料中维生素B12的含量进行了快速检测，实验结果表明经过优化的试剂盒法能够有效缩短实验所需时间，且操作较为简单，将其和国标法进行比较，其具有精准可靠、操作方便的特点。陈敏儿等[12]则比对了国标法和试剂盒法测定维生素胶囊叶酸含量，实验结果表明，国标法和试剂盒法都具有较高的重复性，且两种方法的相对偏差均小于4%。在精密度方面，国标法的回收率保持在100%～105%，相对标准偏差在2%～4%；试剂盒法的回收率则保持在78.5%左右，相对标准偏差高于4%。由此可以看出采用试剂盒法检测精准度较低，但相较于国标法，采用试剂盒法进行检测也有着操作步骤较为简单、污染概率较低以及方便快捷的优点。因此，在实际工作过程中，应结合具体的检测要求来选择最为科学的方法。

4 结语

当今人们对于健康的关注程度越来越高，而维生素B12作为一种维持人体正常新陈代谢的重要有机化合物，必将会引起全社会的广泛关注。虽然现如今针对维生素B12的检测方法多种多样，但每种方法都具有各自的优缺点和适用领域，因此在实际使用过程中，也应结合具体的检测需求选择最为合适的检测方法。随着科学技术的不断进步，维生素B12的检测方法将会朝着更加精准、稳定、快速、高效的方向发展。