低温胁迫下甘蓝型冬油菜抗寒性与叶片激素含量的关联性

范军强　路晓明　王会文　武军艳　刘丽君　马骊　蒲媛媛　李学才　孙万仓

摘要： 為探究不同抗寒性甘蓝型冬油菜在应对低温胁迫时内源激素含量的变化，并阐明其抗寒性与叶片激素含量的关联性，选用感温性差异较大的4个甘蓝型冬油菜品种（品系），分别于4 ℃及0 ℃处理不同时间后测定植株叶片内玉米素（Zeatin，ZT）、赤霉素（Gibberellin A₃，GA₃）、水杨酸（Salicylic acid，SA）、生长素（Indole-3-acetic acid，IAA）和脱落酸（Abscisic acid，ABA）5种内源激素的含量，并联系抗寒性评价指标进行相关性分析。结果表明，与对照（24 ℃）相比，低温处理后甘蓝型冬油菜叶片中IAA、ZT、GA₃含量显著降低，ABA含量较对照（24 ℃）上升2～3倍，不同品种（品系）SA含量增幅差异较大。相关性分析结果表明，ABA、IAA、GA₃、SA含量的耐寒系数与抗寒性呈显著负相关。总之，内源激素含量会随外界温度变化而变化，且强抗寒性甘蓝型冬油菜品种（品系）叶片中激素含量的变化（上升或下降）幅度小于弱抗寒性品种（品系）。

关键词： 甘蓝型冬油菜；低温胁迫；半致死温度；内源激素；抗寒性

中图分类号： S565.401 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0015-07

Association between cold resistance and leaf hormone content of Brassica napus L. under low temperature stress

FAN Jun-qiang^1，2， LU Xiao-ming^1，2， WANG Hui-wen^1，2， WU Jun-yan^1，2， LIU Li-jun²， MA Li²， PU Yuan-yuan^1，2， LI Xue-cai^1，2， SUN Wan-cang^1，2

（1.College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070， China;2.State Key Laboratory of Aridland Crop Science， Lanzhou 730070， China）

Abstract： To study the changes of endogenous plant hormone content in Brassica napus L. varieties （strains） with different cold resistance under low temperature stress， and to clarify the correlation between their cold resistance and leaf hormone content， four B. napus L. varieties （strains） with great difference in temperature sensitivity were selected and were treated at 4 ℃， 0 ℃ for different times， respectively. Then contents of five endogenous hormones in the leaves of the plants were detected， such as zeatin （ZT）， gibberellin A₃（GA₃）， salicylic acid （SA）， indole-3-acetic acid （IAA） and abscisic acid （ABA）， and correlation analysis was made with evaluation indexes of cold resistance. The results showed that， compared with the control （24 ℃）， contents of IAA， ZT and GA₃in leaves of B. napus L. decreased significantly after low temperature treatment， and content of ABA increased by two to three times. The increase amplitude of SA content in different varieties （strains） of B. napus L. was different. Results of correlation analysis showed that， the cold resistance coefficients of ABA， IAA， GA₃and SA contents were significantly negatively correlated with cold resistance. In conclusion， the endogenous hormone content changes with the change of external temperature， and the change （increase or decrease） of hormone content in leaves of B. napus L. varieties （strains） with strong cold resistance was less than that of varieties（strains） with weak cold resistance.

Key words： Brassica napus L.;low temperature stress;Semi-lethal temperature;Endogenous auxin;cold resistance;Correlation analysis

低温逆境下植物内源激素会调控相关结构的建成与功能表达^[1]，同时在植物适应逆境的过程中發挥重要作用。冬油菜种植区在向天水市以西、以北方向扩展的过程中，最早实施的就是甘蓝型冬油菜^[2]。随着北移工作的推进，甘蓝型冬油菜作为蜜源植物、油料作物和观赏作物，具有极大的经济价值与生态价值^[3]。冷胁迫后植物内源激素含量会发生明显变化^[4]，脱落酸（Abscisic acid，ABA）在低温环境下会大量合成^[5]，这会引起相关抗逆蛋白质的合成^[6]。多数学者认为植物激素是抗寒基因表达的启动因素^[7]。阐明低温下抗寒性与激素调控的关系，将为推动冬油菜越冬研究提供新方向。本研究选取感温性差异较大的4个甘蓝型冬油菜品种，低温处理后测定内源激素水平及叶片低温半致死温度，以探究甘蓝型冬油菜抗寒性与叶片激素含量的关联性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取4个感温性不同的甘蓝型冬油菜品种作为试验材料，详见表1。

内源激素含量测定使用四元梯度超快速液相色谱仪（型号：ACQUITY Arc）。5种植物内源激素标准品玉米素（Zeatin，ZT）、赤霉素（Gibberellin A₃，GA₃）、水杨酸（Salicylic acid，SA）、生长素（Indole-3-acetic acid，IAA）和脱落酸（Abscisic acid，ABA），均采购于上海源叶生物科技有限公司。流动相溶液乙腈（色谱专用）、甲醇（色谱专用）、磷酸（分析纯），均采购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.2 试验设计

试验材料以盆栽方式进行种植。各品种种子在2021年8月21日于培养皿中进行萌发，并于2021年8月25日统一移栽。移栽选用直径为25 cm、高度为12 cm的树脂花盆。每盆装入已加水搅拌均匀的育苗基质4 kg，每盆设置3穴，每穴2株苗，株距10 cm，放置于自然条件下生长，地点位于甘肃农业大学。两叶一心期进行间苗，每穴定苗一株，待长至六叶期进行下一步试验。种植期间的栽培管理措施按常规方法进行。

试验共设置5个处理，分别为24 ℃处理12 h、0 ℃处理1 h、0 ℃处理12 h、4 ℃处理1 h和4 ℃处理12 h（全部盆栽均先置于24 ℃培养12 h）。处理过程中尽量保证光照及水分条件的一致。

处理结束后快速取出盆栽并采样，每株展开的第2张叶用于内源激素含量的测定，第3张叶用于低温半致死温度的测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 半致死温度（LT₅₀）的测定 试验材料于24 ℃培养12 h后，用打孔器在展开的第3张叶上打3个直径为5 mm的叶圆片（避开叶脉）。将打好的3个叶圆片装入10 ml离心管中并加入0.2 ml去离子水，对照只加入去离子水，分别置于0 ℃、-4 ℃、-8 ℃、-12 ℃、-16 ℃条件下处理30 min，每个温度下设置3个重复。取出后再加入10 ml去离子水，室温振荡1 h后使用电导仪测出电导率（C1），测得对照电导率为C0。最后置于120 ℃烘箱中煮沸20 min，取出冷却至室温后定容至10.2 ml，测出电导率（C2），按公式计算相对电导率，相对电导率（REC）=（C1-C0）/（C2-C0）×100％。

1.3.2 高效液相色谱（HPLC）法测定内源激素

1.3.2.1 激素的提取 称取0.5 g新鲜叶片，加入液氮快速充分研磨成粉末。加入4 ℃预冷后的80%（体积分数）甲醇（色谱专用）5 ml，使用超声波清洗仪于22 ℃处理2 min，振荡混匀，置于4 ℃浸提12 h。浸提结束后于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，吸取上清液3 ml转移至新离心管，使用真空离心浓缩仪完全浓缩至无液体残留。加入1 ml 80%（体积分数）甲醇（色谱专用），振荡混匀（保证提取物完全溶解于甲醇溶液），过0.22 μm有机滤膜，样品制备完成。

1.3.2.2 标准品的配制 准确称取5种激素的标准品，配制成10 μg/ml的高质量浓度单个标准品，用于出峰时间的确定及混合标准品的配制。将配制好的高质量浓度单个标准品混合稀释为1 μg/L、95 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、600 μg/L、800 μg/L、1 000 μg/L的梯度混合标准品，用于绘制各激素的标准曲线。

1.3.2.3 内源激素的测定方法 色谱柱C18W柱，流动相由甲醇与0.1%磷酸按1∶9的体积比例混合配制而成（超声波处理15 min脱气），检测波长280 nm，流速1 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl，单个样品检测时间30 min。

1.4 数据处理及分析方法

1.4.1 Logistic回归方程分析 对测定的相对电导率进行Logistic回归分析，回归模型为：

其中，Y为相对电导率，t为处理温度，k为细胞伤害率的饱和容量，a、b为方程参数。因本试验中细胞伤害率消除了干扰，故k=100。为确定a、b值，将Logistic方程转化为：

则方程转化为Y′与t之间的线性方程，即：

Y′=lna-bt

半致死温度计算公式为：

1.4.2 激素水平的计算方法 标准曲线的绘制：使用10 μg/ml的高质量浓度单个标准品确定每种激素的出峰时间，使用梯度质量浓度的混合标准品确定5种激素峰面积与质量浓度的线性关系，并绘制标准曲线。依据标准曲线得到样品质量浓度，通过公式计算叶片激素含量：M=C×V/M_S，其中V是定容体积，M_S是样品质量，C为依据标准曲线得到的激素濃度，M为最终叶片激素含量。单项指标耐寒系数（K）=低温测定值/常温测定值。

2 结果与分析

2.1 甘蓝型冬油菜叶片半致死温度

相对电导率可表示细胞膜透性，离体叶片在一定温度范围内的渗透情况具有反映细胞膜受伤程度的作用。当处理温度低于半致死温度时，植物将受到不可逆的伤害，相对电导率快速升高。低温半致死温度的高低是反映植物抗寒性强弱的重要指标。根据LT₅₀测定结果（表2）鉴定4个油菜品种（品系）的抗寒性强弱为gau-24>gau-30>天油2288>天油2266，决定系数为0.86～0.93，可用于进一步分析。

2.2 标准曲线的绘制及回归方程的建立

对单个标准品进行色谱分析，ZT出峰时间为5.084 min，GA₃出峰时间为6.540 min，SA出峰时间为7.306 min，IAA出峰时间为8.039 min，ABA出峰时间为8.985 min。对照出峰时间获得各激素梯度浓度的峰面积，求得各激素浓度与峰面积的线性关系（表3）。

2.3 不同抗寒性甘蓝型冬油菜激素含量

0 ℃、4 ℃测得的激素含量分别列于表4、表5。

分析发现部分激素含量在不同处理间差异显著（P<0.05）。随低温（0 ℃及4 ℃）处理时间的增加，ABA/IAA值、ABA/ZT值、ABA/GA₃值、IAA/GA₃值表现出增大趋势，各激素间协同作用明显。

2.4 不同水平低温对甘蓝型冬油菜内源激素含量的影响

4个甘蓝型冬油菜品种（品系）内源激素对低温胁迫的响应如图1所示。与对照（24 ℃）相比，0 ℃处理12 h后ZT含量平均降幅为35.84%，高于4 ℃处理的平均降幅（28.79%）。GA3含量随低温处理时间延长呈下降趋势，gau-24在0 ℃处理12 h后降至30.55 μg/g，高于天油2288（18.08 μg/g）。gau-30在0 ℃处理12 h后SA含量与对照相比增加460.82%，天油2288增幅仅为95.71%。在0 ℃处理12 h后平均IAA含量为12.13 μg/g，低于4 ℃处理12 h后的平均含量（28.49 μg/g）。在4 ℃及0 ℃处理后ABA含量明显上升，gau-24的ABA含量在0 ℃处理12 h后自CK的6.73 μg/g上升至29.71 μg/g，增加了341.46%，高于天油2266及天油2288在0 ℃处理12 h后的增幅。0 ℃处理12 h后ABA含量平均增幅为282.63%，4 ℃处理12 h后ABA含量平均增幅为205.31%，0 ℃上升幅度较4 ℃大。总体上看，5种内源激素含量随低温处理强度变化而变化，低温处理后ZT、GA₃、IAA含量下降，SA及ABA含量升高，且4 ℃处理的增加或下降幅度小于0 ℃。

2.5 低温胁迫后不同抗寒性甘蓝型冬油菜叶片激素含量与抗寒性的关系

0 ℃及4 ℃处理12 h后甘蓝型冬油菜叶片5种内源激素含量及比值的耐寒系数分别列于表6、表7。ZT、GA₃、IAA的K值均小于1.000，SA、ABA的K值均大于1.000。

利用半致死温度与9个内源激素相关指标的耐寒系数之间的相关性确定甘蓝型冬油菜抗寒性与叶片激素含量的关联性。0 ℃处理12 h后，与半致死温度相关性显著或极显著的指标有GA₃含量、SA含量、IAA含量、ABA含量、ABA/IAA值、ABA/GA₃值的耐寒系数，4 ℃处理12 h后，与半致死温度显著或极显著相关的指标仅有GA₃含量和ABA/ZT值的耐寒系数，GA₃在0 ℃及4 ℃处理后12 h后均与半致死温度极显著相关（表8）。

3 讨论与结论

生长促进型激素和生长抑制型激素对于低温的响应趋势不同^[8]。低温处理下云雾贡茶IAA含量下降明显^[9]。Yamada等^[10]在5 ℃低温处理的枳砧叶片中未检测出细胞分裂素。本试验在0 ℃处理12 h后的甘蓝型冬油菜叶片中虽能检测出玉米素（细胞分裂素的一种），但含量降幅显著。严寒静等^[11]发现，栀子叶片中GA₃含量在自然降温过程中下降明显。低温会促进植物体内脱落酸水平升高，环境温度降低后油菜叶片中脱落酸水平会不断升高^[12]。番茄在感受夜间低温后，脱落酸升高至白天的1.5倍^[13]。李亮等^[14]认为，低温胁迫后SA的积累影响黄瓜幼苗对低温的响应。本研究发现，0 ℃处理12 h后油菜叶片中ABA含量较对照（24 ℃处理12 h）上升2～3倍，SA含量也表现增长趋势。

低温处理后抗寒性强的番茄品种ABA含量高于抗寒性弱的品种^[15]。不同抗寒性油棕品种在10 ℃低温下叶片中的ABA含量变化与番茄相同^[16]。王兴等^[17]认为，强抗寒性冬小麦品种能在低温下较长时间维持高水平的IAA含量。本试验证明，抗寒性越弱的品种叶片中ABA含量在0 ℃处理前后的相对上升幅度越小，IAA含量在低温处理后降幅越小，抗寒性越强。ABA/IAA值的耐寒系数与抗寒性显著相关，证明ABA与IAA的协同作用与抗寒性也有关系，在葡萄中有相似结论，曲凌慧等^[18]认为，强抗寒性品种叶片中ABA/IAA值较高。

植物会响应外界低温环境从而改变内源激素的含量^［19-23］，强抗寒性甘蓝型冬油菜品种叶片中生长促进型激素含量下降幅度小于弱抗寒性品种，生长抑制型激素含量上升幅度大于弱抗寒性品种。相关性分析结果表明，低温处理后GA₃含量的相对变化可作为抗寒性评价的稳定指标。

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（责任编辑：张震林）