秋水仙碱提取分离研究进展

崔光芬　杜文文　金鹏程　段青　王祥宁　贾文杰　马璐琳　王继华

摘要： 秋水仙碱是一种功能较多的植物源生物碱，在医药行业发挥着重要作用。系统地了解秋水仙碱提取、分离的技术类型有助于推动高纯度秋水仙碱的生产。本文介绍了秋水仙碱不同提取技术的特点、原理和应用效果，阐述了秋水仙碱在不同种类植物、植物不同部位中的含量以及影响含量的因素，总结了传统的浸提法、回流法与超声波提取、超临界CO₂提取、微波提取、酶促提取等新提取方法，以及膜分离法、色谱分离法等秋水仙碱分离纯化方法的研究进展，分析了不同提取分离技术的效果和影响因素，探讨了秋水仙碱提取技术的发展方向，以期为秋水仙碱的提取分离技术的研究和应用提供参考。

关键词： 秋水仙碱；嘉兰属；提取方法；分离纯化

中图分类号： R284 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0295-10

Advances in extraction and separation of colchicine

CUI Guang-fen^1，2 ， DU Wen-wen¹， JIN Peng-cheng²， DUAN Qing¹， WANG Xiang-ning¹， JIA Wen-jie¹，MA Lu-lin¹， WANG Ji-hua¹

（1.Flower Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205，China;2.Agro-Products Processing Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650221，China）

Abstract： Colchicine is a plant-derived alkaloid with many functions， which plays an important role in the pharmaceutical industries. Systematic understanding of the technology types for extraction and separation of colchicine is helpful for promoting the production of high-purity colchicine. In this article，the characteristics， principles and application effects of different extraction techniques of colchicine were introduced， and the research progresses on colchicine content in different plants and different parts of plants as well as the affecting factors were described. Traditional extraction methods such as maceration extraction and reflux extraction were summarized. New extraction methods such as ultrasonic extraction， supercritical CO₂extraction， microwave extraction and enzymatic extraction were also summarized. Besides， research progress on separation and purification methods of colchicine such as membrane seperation and chromatographic separation were generalized. The effects and influencing factors of different extraction and separation technologies were analyzed， and the development direction of colchicine extraction technology was discussed to provide reference for the research and application of colchicine extraction and separation technology.

Key words： colchicine；Gloriosa；extraction methods；separation and purification

秋水仙堿是一种三环脂溶性生物碱，于1820年由法国化学家从秋水仙属（Colchicum）植物^[1]中分离获得，其化学结构见图1。秋水仙碱作为治疗痛风的药物应用历史悠久，近年来，其药用价值被不断挖掘并被广泛用于治疗家族性地中海热^[2]、皮肤病^[3]、心脏病^[4]等疾病，甚至用于治疗新冠肺炎引起的急性呼吸窘迫综合征^[5]。秋水仙碱在细胞中可与微管蛋白β亚基上第1～46位和第214～241位2段氨基酸残基发生交联，抑制微管聚合进而影响细胞信号转导、细胞分裂、迁移和细胞运输等多种细胞过程^[6-8]。除药用价值外，秋水仙碱还可用于植物多倍体育种，作为诱变剂诱导植物的茎尖、花粉、根尖、种子等器官或组织获得多倍体品种，进而得到更高的作物产量^[9-10]，或通过改变基因组倍性水平来影响植物代谢物的浓度^[11-12]，甚至在水果保鲜领域也有所应用^[13]。随着秋水仙碱的用途不断拓展，人们对秋水仙碱的需求也快速增长。

生物碱是植物体内产生的次生代谢物，能够保护植物免受食草动物采食和病原体侵害，其传统提取方法包括煎煮、浸渍、渗漉等^[14]。秋水仙碱作为生物碱的一类，常用提取方法有溶剂提取、超声提取等^{[15- 16]}。目前，生物碱提取技术不断创新和发展，更多含秋水仙碱的植物被发现，秋水仙碱的提取范围不断扩大，提取效率也得到较大提升。本研究通过对不同植物中秋水仙碱含量及其影响因素、提取方法、分离纯化等相关研究进行综述，结合目前国内外有关秋水仙碱合成的最新进展，以期阐明不同提取技术的优势和适用范围，为促进秋水仙碱的生产和应用提供参考。

1 秋水仙碱的植物来源

1.1 含秋水仙碱的植物种类

秋水仙碱最早是从秋水仙属植物中提取获得的。近年来，人们在山慈姑属（Iphigenia）^[17]、宫灯百合属（Sandersonia）^[18]、摇船花属（Androcymbium）^[19]、安圭拉氏兰属（Wurmbea）^[20]等秋水仙科不同属植物中发现了秋水仙碱，Vinnersten等^[21]研究认为秋水仙科的植物中普遍含有秋水仙碱，因此提出秋水仙碱可作为秋水仙科植物分类扩展的化学标志物。秋水仙科植物分布于非洲、亚洲、澳大利亚、欧洲和北美的温带和热带地区，科内各属植物均为多年生，地下球茎或块茎发达，全株含秋水仙碱^[22]，除秋水仙科外，百合科百合属（Lilium）^[23]、萱草属（Hemerocallis）^[24]的多种植物中也含秋水仙碱，秋水仙科与百合科是含秋水仙碱植物中最丰富的2个科。另外，菊科风毛菊属的水母雪莲（Saussurea medusa）^[25]和唐古特雪莲（Saussurea tangutica）^[26]，天南星科天南星属的曲序南星（Arisaema curvatum）^[27]，泽泻科慈姑属的慈姑（Sagittaria sagittifolia）^[28]也曾有关于秋水仙碱被提取分离的报道。目前秋水仙碱生产上常用的提取植物为秋水仙属（Colchicum）、山慈姑属（Iphigenia）和嘉兰属（Gloriosa）^[29-30]。嘉兰是一类攀缘植物，在印度分布广泛，其种子和块茎被大量出口至欧美用于药用秋水仙碱提取^[31]，而山慈姑属的丽江山慈姑则是中国药企生产秋水仙碱常用的基源植物^[32]。

1.2 不同植物中的秋水仙碱含量

秋水仙碱虽然在越来越多的植物中被发现和提取，但已报道的不同种类植物在秋水仙碱含量上差别较大（表1）。商业用途的秋水仙碱最早从秋水仙（Colchicum autumnale）中提取获得，该物种的种子中秋水仙碱质量分数为0.5%～0.6%^[33]。Pandey等^[34]从嘉兰（Gloriosa superba）的干燥块茎中提取秋水仙碱，其质量分数可高达0.91%。除秋水仙属和嘉兰属外，前人还在山慈姑属、宫灯百合属和摇船花属植物中发现了一些秋水仙碱含量高的种类，如宫灯百合（Sandersonia aurantiaca）的块茎中秋水仙碱含量为1.07%（质量分数）^[18]，山慈姑属植物（Iphigenia indica）球茎中秋水仙碱含量为3.250 mg/g ^[17]，摇船花属植物（Androcymbium hierrense）的种子中秋水仙碱含量为4.500 mg/g ^[21]。即使是在相同屬内，不同种间植物的秋水仙碱含量差异也较大，在6种安圭拉氏兰属植物中，Wurmbea deserticola和 W. tenella的秋水仙碱含量分别为1.700 mg/g和0.300 mg/g^[20]。

1.3 影响植物秋水仙碱含量的因素

1.3.1 环境因素 在不同气候土壤条件下生长的植物种群其生化代谢方面存在差异。李慧芳等^[35]采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）法分析野罂粟（Papaver nudicaule）不同居群的生物碱含量，结果表明，野罂粟中主要的3种生物碱包括野罂粟碱、黑龙辛甲醚和瑞芙热米定的含量在不同居群中各不相同，前2种生物碱含量最大值均出现在乌兰布统居群，分别为2.018 5 mg/g和1.138 2 mg/g。而瑞芙热米定含量的最大值则出现在多伦居群（1.287 8 mg/g）。综合比较各居群间生物碱含量差异，结果显示，乌兰布统地区的野罂粟品质最佳，生物碱类成分含量最高，由此说明生物碱在植物中的含量与生长区域相关。Pandey等^[36]对来自印度32个不同地理位置的嘉兰居群进行秋水仙碱含量检测，结果显示，在印度11个州32个不同地区的嘉兰居群中，秋水仙碱含量为2.12～7.58 mg/g。秋水仙碱含量最高的居群为印度东部地区的大吉岭-西孟加拉邦居群（7.58 mg/g）和甘托克-锡金居群（7.37 mg/g），东喜马拉雅高海拔地区嘉兰居群的秋水仙碱含量明显高于西喜马拉雅地区和印度-恒河平原的居群，说明在2 045 m海拔范围内生长的嘉兰居群的秋水仙碱含量受到生境海拔的调控，这种受海拔影响次生代谢物合成的变化归因于一些生理、生态和环境因素，即紫外线辐射水平的高低、温度水平差异等。袁理春等^[37]对云南西北部及四川越西县分布的22个丽江山慈姑（I. indica）居群中秋水仙碱含量的测定结果表明，分布在金沙江两岸贫瘠砂砾土壤上的丽江红岩居群秋水仙碱质量分数最高，达0.61%， 而生长在较肥沃的草丛中的永胜县板桥乡居群质量分数仅为0.13%，说明丽江山慈姑秋水仙碱含量与生境土壤的土质关系较大。

1.3.2 生长周期和栽培措施 植物中的生物碱含量受生长年限和季节的影响。Akram等^[38]研究石蒜球茎中生物碱含量时发现，两年生球茎中的加兰他敏和石蒜宁碱的含量最高，而在三年生球茎中网球花胺的含量最高，一年生球茎中的高石蒜碱含量较高，综合比较可知，两年生球茎中的生物碱含量最高。在约旦原产的2种秋水仙属植物中，Alali等^[39]发现C. tunicatum在花期、营养生长期和苗期的秋水仙碱含量较高，而在C.brachyphyllum中，花期和苗期的秋水仙碱含量较高。此外，在栽培过程中，施肥也有利于秋水仙碱在球茎和叶片中的积累。Al-Fayyad等^[40]按照氮磷钾5∶10∶5的施用比例，在种植10 d后施用3种用量的配方肥，结果显示，在不同施肥水平下，C. hierosolymitanum和C. tunicatum球茎中的秋水仙碱含量均高于对照，尤其是氮磷钾配比为75∶100∶75的处理秋水仙碱含量最高，秋水仙碱含量分别为0.806 mg/g和0.803 mg/g，C. hierosolymitanum球茎中秋水仙碱含量甚至高于未施肥（对照）80%以上，说明施肥能够促进植物中秋水仙碱的合成。

2 秋水仙碱的提取方法

生物碱为含氮有机物，传统提取方法包括煎煮、浸渍、渗漉等，由于大多数生物碱能溶于三氯甲烷、乙醚、乙醇、丙酮等有机溶剂，也能溶于酸性、碱性水溶液形成盐类，因此可选用不同溶剂提取植物中的生物碱。随着提取技术不断发展，双水相萃取^[41]、低共熔溶剂提取^[42]等新技术也被應用到生物碱提取中。天然秋水仙碱在植物中的分布因器官组织不同而不同，因此提取方法也可根据原材料特点及提取效率等要素进行选择。

2.1 浸提法

2.1.1 水提取法 水提法直接以水为溶剂，适用于提取在水中溶解度较高的化合物。秋水仙碱易溶于水，Agrawal等^[15]以水为溶剂在室温下浸渍嘉兰茎块的干燥粉末，获得的秋水仙碱质量分数可达0.31%。除纯水外，酸和碱的水溶液也常用于生物碱提取。生物碱通常与盐酸形成生物碱氯化物，其在水中的溶解性优于碱性生物碱，ankaya等^[43]用浓度0.1 mol/L的盐酸提取C. autumnale球茎中的秋水仙碱，提取过程辅以超声技术，结果表明，提取时间、提取介质的pH值、液料比、提取温度和超声功率对提取效率影响较大。在pH值为1、料液比为1∶30（质量体积比）、超声时间为40 min、温度为64 ℃时，提取效率最高，秋水仙碱质量分数达0.238%。黄晨熙等^[44]以pH 2.8～4.5的柠檬酸或苹果酸水溶液烫漂百合花瓣干粉，将烫漂液制作成浸膏后加入乙醇制成提取液，浸膏与乙醇的料液质量比为1∶15～1∶30，提取温度为40～60 ℃，提取时间为30～50 min，提取液经固相萃取后可获得秋水仙碱提取物，纯度78%以上。

2.1.2 有机溶剂提取法 甲醇、乙醇、三氯甲烷等有机溶剂是秋水仙碱提取中常用的提取溶剂。针对不同的提取材料，秋水仙碱提取剂可选用单一的有机溶剂，也可用混合溶剂。

姚红锐等^[45]用百合鳞茎干粉和乙醇混合物（1∶3，体积比）进行冷浸提，提取时间4 h，提取3 次后秋水仙碱的提取率为1.96%。而陈莉华等^[46]同样以百合干燥粉末为材料，以体积分数95%的乙醇浸泡后在80 ℃下提取8 h，提取液浓缩溶于水后再分别用石油醚、乙醚和三氯甲烷萃取，将每种萃取剂获得的萃取物合并得到秋水仙碱粗提物，分步提取使百合原料中秋水仙碱的提取率最大化，此试验结果说明，对百合中秋水仙碱提取率产生影响的因素按其作用大小排序分别为：提取温度＞料液比＞乙醇体积分数＞提取时间。

2.2 回流法

回流提取是以乙醇等沸点低的有机溶剂与原料混合后在水浴中加热，溶剂挥发后经冷凝作用重新回流到提取容器中提取目标成分。田素英等^[17]以一定粒度范围内的山慈姑药粉为原料，以体积比75%的乙醇溶液作为提取剂，经4次回流提取后，秋水仙碱提取量为2 983.6 mg/kg。对于山慈姑中秋水仙碱回流提取的效果而言，粉末的粒径越小，提取效果越好，并且乙醇浓度、提取次数、乙醇用量对提取得率的影响较大。管伦兴等^[47]以体积比70%的甲醇对丽江山慈姑粉末中的秋水仙碱进行回流提取，结果表明，回流2次可将原料中的秋水仙碱完全提取出来，提取效率明显高于超声提取法。

2.3 超声提取法

超声波是一种高频机械波，可产生高速、强烈的空化效应高效破碎细胞，增强细胞壁和细胞膜的通透性及溶剂的穿透力，使提取溶剂更易接触目标成分，从而提高目标化合物的溶出速度和溶出量^[48]。Ou等^[28]采用超声法对慈姑球茎干粉中的秋水仙碱进行提取，体积分数为60%的乙醇溶液在50 ℃的温度条件下超声提取30 min，料液比（质量体积比）为1∶25，秋水仙碱的平均提取得率可达0.27%，在此研究中秋水仙碱的提取率随超声时间增加而增加，但超声时间为30 min时，秋水仙碱的提取率达到峰值，之后虽然提取时间延长但秋水仙碱提取率逐渐降低，原因可能与提取物中非靶标物质的增加有关。ankaya等^[43]以超声辅助法提取C. autumnale球茎中的秋水仙碱，结果显示，超声波功率为602.4 W、提取时间为42 min、温度为64 ℃时，秋水仙碱的得率最高，超声处理40 min后提取率升高，表明超声波可促进目标化合物在溶剂中扩散，并在短时间内实现溶解平衡。同时，当料液比（质量体积比）从1∶15增加到1∶30时，提取效率提高21%，但是料液比大于1∶30（质量体积比）以后，提取效率变化不显著，原因可能是溶剂与溶质比增加时，溶质扩散过程加快，且迅速达到溶解力最大值。

2.4 超临界CO₂萃取法

超临界CO₂萃取法以处于临界状态的CO₂为媒介，其具有双重优点，既有液体对物料的高渗透性和溶解能力，又有气体的高扩散性和低黏度，仅通过控制压力和温度即可选择性地把不同极性、不同沸点和不同相对分子质量的成分萃取出来，而且在提取物中溶剂无残留^[49]。Bayrak等^[16]将C. speciosum的种子磨碎后经脱脂处理去除油分，以超临界CO₂技术萃取秋水仙碱，选用0.5 ml/min甲醇为改性剂，CO₂流速为1.50 ml/min，CO₂密度为0.90 g/ml，获得的萃取物中只含有秋水仙碱，得率为1.44%，说明超临界CO₂流体对秋水仙碱具有选择性，脱脂和添加甲醇改性剂可提高种子中秋水仙碱的萃取率。对于含有大量淀粉和多糖的百合鳞茎而言，经过氨水充分碱化后，更多的秋水仙碱可从原料中释放出来，有利于后续的超临界CO₂流体萃取。此外使用提携剂萃取也可提高秋水仙碱萃取率，乙醇因渗透力较强，与秋水仙碱之间以氢键结合有利于萃取，适合作为超临界CO₂流体萃取百合中秋水仙碱的提携剂^[50]。Ellington等^[33]通过考察CO₂不同密度、改性剂百分比、提取温度和萃取时间，建立从C. autumnale种子中提取秋水仙碱的超临界CO₂萃取法，即在恒定的CO₂密度（0.90 g/ml）和通量（1.5 ml/min）条件下，以体积分数3%的甲醇为改性劑，可在110 min内提取98%的秋水仙碱，与传统提取方法相比，超临界CO₂萃取法更高效、快速、环保。

2.5 微波助提法

微波辅助提取的作用力主要来源于微波对细胞膜的生物效应。微波能穿透组织细胞，导致细胞内压力和温度升高，当压力超过细胞承受能力时细胞膜破裂，各种有效成分将从细胞进入溶剂中^[51]。Pandey等^[36]以微波助提法对嘉兰中的秋水仙碱进行提取，主要参数设置为：微波功率300～600 W，提取时间3～9 min，溶剂为20%～40%（体积分数）的乙醇水溶液，溶剂pH为 2～6。通过比对获得最优提取条件：微波功率460 W，微波处理时间6.4 min，乙醇水溶液的体积分数为30%，pH值为3，在此条件下获得的秋水仙碱含量达到最大值（7.51 mg/g）。Agrawal等^[15]同样以微波助提法提取嘉兰块茎中的秋水仙碱，结果显示，在最佳提取条件下，即微波功率245 W、微波处理时间15 min、提取溶剂为100%甲醇时，秋水仙碱的质量分数为0.64%。

2.6 酶促提取法

酶在提取过程中可降解细胞壁及细胞间质中的成分，通过破坏细胞渗透阻力，将细胞内的有效成分分离出来^[52]。黄旖旎等^[53]将百合粉与磷酸盐缓冲液混合加热糊化，之后采用NaOH溶液碱化和α-淀粉酶溶液恒温酶解，最后以三氯甲烷萃取，结果显示，在 2～10 U的酶量范围内，随着酶量提高，提取液中葡萄糖浓度增加，秋水仙碱的提取率也相应提高。淀粉酶不同用量处理的秋水仙碱提取率均高于对照，原因可能是α-淀粉酶在降解淀粉时，淀粉被水解成较小的葡萄糖分子，能够使更多被淀粉结构包围的秋水仙碱释放出来，由此说明加入淀粉酶可提高百合鳞茎中秋水仙碱的提取率。

2.7 双水相萃取法

双水相萃取系统是由2种化学结构不同的亲水性聚合物，或一种亲水性聚合物、低相对分子质量亲水性有机溶剂与无机盐在水中以适当浓度形成的互不相容的两水相系统，当目标物进入双水相体系后，因相对分子质量大小、电荷作用和各种力的存在以及环境影响使其在上相和下相中浓度不同而实现分离^[41]。石瑶等^[30]以聚乙二醇（PEG）与（NH₄）₂SO₄形成的双水相体系萃取丽江山慈姑中的秋水仙碱，发现PEG相对分子质量大小与双水相成相体系的组成及成相后的相比有关，随着PEG相对分子质量增加，相同浓度的PEG成相所需的盐量逐渐减少，成相能力为PEG6000＞PEG4000＞PEG2000＞PEG600＞PEG400。当pH为7.0、PEG6000质量分数为8%、（NH₄）₂SO₄质量分数为20%时，秋水仙碱主要集中于上相（PEG相），质量浓度为0.749 6 mg/ml。双水相体系对丽江山慈姑粗提液中秋水仙碱的萃取率达82.09%，富集倍数为6.84倍。此方法与传统的液液萃取、固相萃取等方法相比，具有操作简单、萃取条件温和、不使用有机溶剂等优点，除在蛋白质、酶、核酸的分离和纯化方面具有广阔的应用前景外^[54]，也为生物碱类化合物的萃取分离提供了一种有效方法。

2.8 其他方法

除上述方法外，生物碱提取已从使用单一方法演变为多种方法的集成应用。李璐等^[55]采用正交试验法建立了淫羊藿生物碱的超声波-微波协同提取工艺，淫羊藿叶片粉末密封浸泡40 min后在超声波-微波协同作用下萃取18 min，微波功率250 J/s， 液固比为30 ml/g， 乙醇溶液体积分数为70%，淫羊藿生物碱的提取率可达16.146 mg/g，显著高于超声波提取法、微波提取法和加热提取法。刘谋盛等^[56]采用超声波辅助双水相萃取系统从山慈姑中提取秋水仙碱，原料中加入其质量3～5倍的乙醇（80%～95%，体积分数）和原料质量4～6倍的水，浸泡后加入原料质量0.5～2.0倍的硫酸铵、硫酸钠或甲酸钠中的一种，在温度40～70 ℃、频率30～200 kHz的超声波作用下进行双水相萃取30～60 min。富含秋水仙碱的上层溶液减压浓缩形成含秋水仙碱的浸膏，经脱盐纯化和大孔吸附树脂柱分离后得到纯度大于95%的高纯度秋水仙碱。此方法以超声波辅助萃取，提高了秋水仙碱的萃取率，双水相萃取同时又对目标化合物起到分离纯化的作用，在秋水仙碱的生产上具有一定的应用前景。

2.9 不同提取方法的比较

秋水仙碱的不同提取方法均具有各自的优点和局限性，并且由于含秋水仙碱的植物种类多样且含量差异较大，因此相同提取方法在不同植物上的应用效果也有一定差别。Agrawal等^[15]同时采用5种方法提取嘉兰茎块中的秋水仙碱，结果显示，与其他方法相比，微波助提法的用时最短，溶剂消耗量最少，提取效率最高。浸提法以水为提取剂经24 h提取得到的秋水仙碱质量分数为0.310%，超声提取法以体积分数50%的甲醇水溶液提取4 h，秋水仙碱得率为0.270%，而微波助提法在功率245 W时以甲醇为提取剂仅需提取15 min，秋水仙碱含量即可达0.640%（质量分数）。Bayrak等^[16]通过比对超临界CO₂萃取与传统提取法对C. speciosum种子中秋水仙碱的提取差异时发现，经过脱脂处理的种子膏状物用200 ml体积比为95∶5的甲醇-水混合液振荡浸提24 h，同时在提取过程中采用2次各30 min的超声波辅助提取，可获得最高的提取得率（4.12%），但所得提取产物中除秋水仙碱外还含有秋水仙苷、3-去甲秋水仙碱2种秋水仙碱的衍生物，秋水仙碱的提取率取决于溶剂体积和振荡周期。而超临界CO₂萃取在35 ℃、CO₂流速1.50 ml/min、CO₂密度0.90 g/ml提取5 h的条件下，秋水仙碱的得率为1.44%，提取物仅含有秋水仙碱和另一种未知化合物。由于超临界CO₂萃取过程使用甲醇作为改性剂，因此除节约时间外，超临界CO₂萃取并未体现出更多区别于传统提取法的优势。黄旖旎等^[53]将百合粉末在85 ℃高温下糊化处理后用α-淀粉酶进行酶解，再以三氯甲烷为溶剂浸提原料中的秋水仙碱，结果证实α-淀粉酶酶解可以提高百合粉末中秋水仙碱的提取得率，此方法操作步骤简便，用时较短，但需使用三氯甲烷为提取溶剂，对环境有一定污染。表2简要比对了各种提取方法的提取时间、试剂、技术要点及秋水仙碱提取得率，微波助提法在提取时间和得率方面显示出极大的优势，具有较高的实际应用价值。

3 秋水仙碱的分离纯化

3.1 膜分离技术

膜分离技术是以选择性透过膜为分离介质，借助液体的浓度差或电位差为推动力，对混合物中的特定组分实现分离、提纯和浓缩的分离技术^[57]。在药物分离上常用的膜技术主要包括微滤（滤膜孔径≥0.1 μm）、超滤（滤膜孔径10.0～100.0 nm）、纳滤（滤膜孔径1.0～10.0 nm）和反渗透（滤膜孔径≤1.0 nm）4类。微滤膜为均匀的多孔薄膜，厚度为90～150 μm，操作压力为0.01～0.20 MPa，过滤粒径为0.025～10.000 μm，常用于截留粒径大于0.1 μm的微粒^[58]。以微滤膜过滤粗提液是秋水仙碱提取纯化中常用的方法，0.45 μm的微滤膜适用于对不同提取方法获得的秋水仙碱粗提液进行分离纯化，为后续采用HPLC定量测定秋水仙碱的浓度提供高纯度溶液^{[15，24，37，43]}。Gumustas等^[59]从C. speciosum和G. superba的种子中提取秋水仙碱时发现，以甲醇为溶剂稀释秋水仙碱提取物再以0.45 μm的微滤器进行过滤，在随后的浓度检测中没有观察到由基质引起的其他化合物干扰，说明选择甲醇溶剂和微滤分离结合的提取效果较好。

3.2 色谱法

3.2.1 薄层色谱法 薄层色谱利用涂布于平板上的物质的吸附能力的差异，使混合溶液流经固定相时被吸附，从而获得目标提取物。Alali等^[60]以石油醚提取2种秋水仙球茎、叶和花中的秋水仙碱，将粗提物溶于体积分数70%的乙醇并以硅胶制备的薄层色谱板进行分离，秋水仙碱经分离后显示为黄色区域，将其从平板上取出溶于乙醇盐酸溶液即可用紫外分光光度法测定秋水仙碱含量。Bodoki等^[61]为检测秋水仙种子中秋水仙碱的含量，采用薄层色谱法分离秋水仙碱的乙醇提取物，在温度20～24 ℃和湿度46%～56%的条件下以三氯甲烷-丙酮-二乙胺（5∶4∶1，体积比）的溶剂体系作为流动相，混合物分离后在350 nm反射率和254 nm荧光模式下进行密度扫描测定，结果显示，对于来源未知的待检样品，薄层色谱法更容易消除其背景干扰，可作为快速、准确定性和定量测定不同基质中秋水仙碱的标准技术，具有样品预处理流程简单、成本较低和可高通量检测样品的优点。

3.2.2 柱色谱分离法 柱色谱分离原理与薄层色谱法相同，但柱色谱分离通量大且效率高、适用范围广、操作更简单。柱色谱常用的吸附剂或载体主要有硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、环糊精键合凝胶、氧化铝、大孔树脂、纤维素粉和离子交换树脂等^[62]。Kannan等^[63]采用柱色谱法分离得到嘉兰种子的秋水仙碱粗提物，分离柱填充中性氧化铝，洗脱剂为体积比97∶3的三氯甲烷和甲苯混合液，分离后的秋水仙碱结晶纯度高达99.9%。Joshi等^[64]用体积分数为90%的甲醇对嘉兰种子中的秋水仙碱进行第一次提取，甲醇提取物通过真空浓缩后再用二氯甲烷进行第二次提取，获得的干物质经多步清洗去除酚类杂质之后溶于乙醇，乙醇溶液经过活性炭柱洗脱，得到分数为96.7%的秋水仙碱，再经中性氧化铝柱进一步纯化，最终获得质量分数为99.82%的秋水仙碱。由此说明氧化铝柱可分离高纯度的秋水仙碱，并且氧化铝柱色谱可与其他分离手段结合使用，将氧化铝柱分离作为最后的纯化步骤能够使化合物的分离效果达到最优。

3.3 树脂吸附法

常规树脂分为离子交换树脂和吸附树脂，大孔吸附树脂是一类高分子聚合物，具有大孔网状结构和较大的比表面积，理化性质稳定，吸附力强且易洗脱，可循环使用^[65]。李晓静等^[66]以秋水仙碱提取液为大孔树脂的上样液，比较5种不同型号的大孔树脂（D101为非极性，LSA5B、LSA21 为弱极性，HPD600 和 LSD001为极性大孔吸附树脂） 的吸附解吸性能，不同极性的大孔吸附树脂依次用NaOH溶液、HCl溶液和95%（体积分数）乙醇浸泡、水洗后再进行筛选，结果表明，树脂的极性、比表面积和平均孔径的大小直接影响树脂的吸附容量和解析率，非极性树脂D101和弱极性树脂LSA5B和LSA21对秋水仙碱的吸附量较大，但LSA21和D101吸附达到平衡所需时间较长，LSA5B吸附达到平衡所需时间较短，且有较高解析率。在pH值2.5、上样体积流量1.5 BV/h、秋水仙碱饱和吸附量26.49 mg/g时，用体积分数70%的乙醇洗脱，洗脱体积流量1.5 BV/h的条件下，LSA5B大孔树脂对秋水仙碱的吸附率达98.16%，秋水仙碱的质量浓度比富集前提高25倍。近年来，树脂吸附除应用在分离纯化粉末状原料中的秋水仙碱外，用树脂吸附培养基中的秋水仙碱也有相关研究报道。Nasreen等^[67]在秋水仙种子的培养基中发现，占总含量40%～70%的秋水仙堿是由标记前体合成的秋水仙碱，表明在种子内合成的秋水仙碱被释放到培养基中。Aroud^[68]对C.autumnale和G.superba进行愈伤组织及根组织的悬浮培养，用非极性的大孔树脂XAD-4、XAD-16和中极性的大孔树脂XAD-7吸附液体培养基中的秋水仙碱，将树脂封闭在尼龙网袋中与细胞悬浮培养物一起孵育，XAD-4和XAD-16 2种树脂对秋水仙碱的吸收率分别达到98.0%和99.5%，由此说明树脂吸附不仅可以高效纯化分离物，在细胞工程中还可以大大提高目标化合物的生产效率。

3.4 秋水仙堿不同分离纯化方法的特点

秋水仙碱的分离纯化研究多集中于膜分离技术、色谱分离和树脂吸附3类方法。膜分离技术在生物碱的分离纯化方面应用广泛，秋水仙碱分离纯化常采用0.45 μm孔径的微滤膜进行初级纯化，滤液需协同其他分离手段再经过进一步纯化才能得到纯度更高的秋水仙碱产品^[37，43]。色谱法利用待分离物在固定相中吸附分配的微小差别，将各种性质极相似的组分彼此分离。Bodoki等^[61]采用以硅胶60为固定相的薄层色谱分离从C. autumnale中获得的秋水仙碱粗提物，证实此法可消除秋水仙碱因光照产生降解产物的干扰，将有生物活性的秋水仙碱准确地分离出来，说明薄层色谱法可作为定性、定量分离秋水仙碱的标准技术，广泛应用于制药工业中快速、准确地分离秋水仙碱。柱色谱分离可使用的吸附剂种类较多，秋水仙碱常用的吸附剂为中性氧化铝，由柱色谱分离获得的秋水仙碱纯度高达98%以上^[63-64]。大孔树脂在生物碱的分离纯化领域应用广泛，但因其种类繁多，选择时应满足目标成分对树脂吸附容量和解析率的要求。在秋水仙碱纯化时筛选过的树脂型号包括LSA5B、LSA21、LSD001、HPD600、D101等^[66]，非极性和弱极性的大孔吸附树脂显示出对秋水仙碱吸附量更大、过滤速度更快、解析更容易等优点。由于树脂吸附性能稳定，可回收再利用，与膜分离技术集成联用，可充分发挥各自的工艺优势，获得纯度更高的化合物单体。

4 结论与展望

目前大多数植物次生代谢物产品的获取都是通过田间栽培或从自然栖息地收集的植物材料中提取纯化^[69]，秋水仙碱的生产仍然以从栽培植物中提取为主，因此，秋水仙碱含量高的植物一直是人们寻找的热点植物。嘉兰的秋水仙碱质量分数（0.90%）高于秋水仙的秋水仙碱质量分数（0.62%）^[60]，且种植范围较广，逐步成为生产秋水仙碱的主要基源植物^[18]。在提取方法上，对于种子类原料，Bayrak等^[16]在提取前增加脱脂步骤，提高了秋水仙碱的提取率，而对球茎、块茎类材料，采用酶解或碱化等^[50，53]处理方法去除淀粉和多糖成分，减少此类物质对提取过程的干扰，可获得更高的秋水仙碱提取得率。随着秋水仙碱的提取方式越来越多样，仅凭单一提取技术常常难以满足多个目标。传统提取方法效率低，耗时较长，提取过程需要使用大量对环境有污染的试剂，而单独使用超声辅助、超临界CO₂萃取、酶辅助、双水相萃取等方法虽能加快提取速度，但并不能大幅提升秋水仙碱的提取得率。因此，由不同提取技术组合而成的协同提取法应用价值极高，可针对各种技术优势互补的原则形成高效的协同提取法，减少使用有毒试剂，降低生产成本，以利于秋水仙碱提取技术的工业化应用将是今后研究的主要方向。

在秋水仙碱的分离纯化研究方面，膜分离、色谱分离和树脂吸附技术取得了一定的研究进展。膜分离过程操作简单，常用于秋水仙碱粗提液的分离纯化，与色谱分离或大孔树脂吸附协同作用可得到高纯度的秋水仙碱。大孔树脂因具有吸附量大、分离高效快速等优点，最宜于在工业生产中使用。随着Nett等^[70]阐明嘉兰（G. superba）中完整的秋水仙碱生物合成途径，并在烟草中成功重现秋水仙碱的合成过程，后续针对生物合成秋水仙碱的特异性分离将会成为一项必要的研究，将不同分离纯化技术的优势整合，减少操作步骤，降低成本，筛选环保型的分离介质，是下一步秋水仙碱分离纯化需要开展的工作。

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（責任编辑：陈海霞）