胎膜早破孕妇生殖道无乳链球菌血清型分型和耐药基因分析

杨 柳，付 欣，张小飞（西北妇女儿童医院医学检验中心，西安 710061）

B 族链球菌（group B Streptococcus，GBS）又称为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），是一种革兰阳性兼性厌氧链球菌，通常定植于女性生殖道和胃肠道。妊娠期携带GBS 可导致孕妇早产、胎膜早破、产褥期感染等不良妊娠结局[1]。若不进行及时的干预治疗，约50%携带GBS 的孕妇会将此菌传播给胎儿，引发新生儿早发型GBS 病，导致严重的败血症和脑膜炎甚至死亡。因此，GBS在国际围产医学中具有不可忽视的地位。荚膜多糖作为GBS 的主要毒力因子，其血清型通常用于菌株表征、疫苗开发及对人类GBS 流行病学的研究[2]。GBS 血清型分型和耐药基因携带率存在明显的地理差异，本文旨在了解西安地区胎膜早破孕妇生殖道GBS 血清型分型、抗生素耐药性和耐药基因携带情况，指导临床医生合理用药，避免耐药株的产生。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2020年1月～2021年12月西北妇女儿童医院产科分娩的50 例胎膜早破孕妇生殖道分离的GBS 菌株。纳入标准：①符合胎膜早破诊断标准[3]；②符合《预防围产期B族链球菌病（中 国）专家共识》[4]；③产妇年龄在 20～45 岁之间，孕周36～41 周。排除标准：①有严重感染的患者；②并发严重妊娠并发症的患者；③并发内科疾病的孕妇。本研究获得所有产妇知情同意，符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 VITEK2 compact 全自动微生物分析系统及配套的鉴定卡和药敏卡片（法国梅里埃）；5%（v/v）绵羊血琼脂平板（环凯生物）；药敏纸片（温州康泰）；细菌基因组DNA 提取试剂盒（天根生物，DP302）；引物由上海生工生物公司合成；PCR 扩增仪（美国赛默飞ABI-7500）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：采用一次性无菌阴道拭子，在孕妇阴道下段1/3 处旋转1 周，收集阴道黏膜分泌物标本，置于无菌试管送检。

1.3.2 GBS 分离鉴定及药敏试验：根据第四版《全国临床检验操作规程》进行菌株鉴定及药物敏感性试验，质控菌株为肺炎链球菌ATCC 49619。

1.3.3 红霉素及克林霉素耐药表型筛选试验：参照2016 版CLSI M100 S26 对红霉素和/或克林霉素耐药的GBS 采用双纸片扩散法进行耐药表型筛查试验，0.5 麦氏单位的GBS 菌液均匀涂布于绵羊血琼脂培养基上，将15µg 红霉素和2 µg 克林霉素贴在相邻的位置，间距12 mm，5ml/dl CO2培养箱35℃孵育20～24h。结果判读：在红霉素相邻侧克林霉素抑菌圈边缘出现截平（似大写的D 字形），为诱导型克林霉素耐药（iMLS），报告D 试验阳性，应将克林霉素修正耐药报告；若对红霉素和克林霉素均耐药，为结构型耐药（cMLS）；对红霉素耐药，对克林霉素敏感且D 试验阴性，为M 型耐药；对克林霉素耐药，对红霉素敏感，为L 型耐药。

1.3.4 GBS 血清型分型：采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取GBS 分离株的DNA 作为PCR 模板，针对GBS 的10 个血清型从文献中选取11 对引物[5]（其中2 对引物针对同一血清型，以验证其准确性），采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)进行核酸扩增，确定不同GBS 分离株的血清型。多重PCR 反应体系包括：10×PCR 缓冲液2.5 µl，MgCl22 mmol，dNTP 200 µmol，引物250 nmol（其中引物1 和16 浓度为400 nmol），DNA Taq 聚合酶0.3 U，5 µl DNA 模板，加无核酸酶水至25 µl。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性60 s，54 ℃退火60s，72 ℃延伸2 min，15 个循环；再95℃变性60 s，56℃退火60 s，72℃延伸2 min，25 个循环，最后72℃延伸10 min。4℃保存。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。引物见表1。

表1 GBS 血清型检测多重PCR 引物

1.3.5 耐药基因检测：采用普通PCR 方法对红霉素和左氧氟沙星耐药的GBS 分离株进行耐药基因检测（ermB，ermTR，mefA/E 和gyrA，gyrB，parC，parE）。模板DNA 提取方法同上，选取8 对引物[3]见表2。反应体系包括：模板DNA 1.25 μl，10×PCR 缓冲液 2.5 μl，MgCl21.5 μl，上下游引物各1 μl，dNTP 0.5 μl，DNA Taq 酶0.25 μl，无核酸酶水补充到25 μl。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共35 个循环，72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

表2 GBS 抗生素耐药基因检测PCR 引物

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行分析。计数资料采用率(%)进行统计学描述。

2 结果

2.1 GBS分离株血清型分布和耐药情况 见表3。50株GBS 分离株中检测到4 种血清型，主要为Ⅲ型（24株，48.0%），其次为Ⅰb 型（12 株，24.0%），Ⅰa 型（10 株，20.0%）和Ⅴ型（4 株，8.0%）。药敏结果显示：所有GBS 分离株对青霉素、头孢曲松、万古霉素和利奈唑胺的敏感度为100%，对红霉素、克林霉素和左氧氟沙星的耐药率分别为 80.0%，74.0%和 56.0%。

表3 胎膜早破患者GBS 分离株的耐药率［n=50，n (%)］

2.2 红霉素及克林霉素耐药表型研究 见表4。80%GBS 分离株对红霉素耐药，耐药表型主要为cMLS 型（34/40，85.0%），其次为M 型（4/40，10.0%）和iMLS 型（2/40，5.0%）。红霉素耐药中血清型III 型最为常见。

表4 40 株红霉素耐药GBS 分离株的耐药表型［n (%)］

2.3 GBS 分离株耐药基因研究 见表5。40 株红霉素耐药株检测到 5 种基因型，主要为ermB 和ermB+mef（A/E）（33/40，82.5%）基因型。cMLS型耐药株主要携带ermB 基因，所有M 型耐药株均携带mef（A/E）基因，所有iMLS 分离株均携带ermTR 基因。

表5 40 株红霉素耐药GBS 分离株的耐药基因型［n(%)］

2.4 28 株左氧氟沙星耐药GBS 分离株的耐药基因型 见表6。28 株左氧氟沙星耐药株检测到4 种基因型，包括gyrA，partC，gyrA+partC 及gyrA+partC +partE 。分离株对左氧氟沙星的抗性主要与gyrA+ partC 和gyrA+partC+partE（26/28，92.9%）有关。

表6 28 株左氧氟沙星耐药GBS 分离株的耐药基因型［n (%)］

3 讨论

胎膜早破是最常见的孕产妇并发症，而细菌感染是引起胎膜早破的重要致病因素[6]。有研究表明，GBS 对绒毛有强大的吸附能力和穿透能力，定植于女性生殖道和宫颈的GBS 可通过产生多种炎症因子引发炎症反应使胎膜局部张力降低，从而导致胎膜早破，继而引发宫内感染[7]。根据细胞壁上特异性的S 物质，可将GBS 细分为10 个血清型：Ia，Ib，II-IX 等[8]。血清型与致病性之间存在相关性，血清型III 和Ia 是孕妇GBS 全身性感染的常见型，其次为V 和 Ib 型[9-10]。本研究中，血清型III 是胎膜早破孕产妇生殖道GBS 的主要血清型（48%），与Ⅰa,Ⅰb 和V 型共占GBS 分离株的94%，这一数据与全球评估的数据接近：Ia，Ib，II，III 和V占所有血清型的98%[11]，未见血清型Ⅳ，Ⅵ，Ⅷ或Ⅸ型，这几种血清型在其他亚洲人群GBS 的相关研究中同样比较罕见。不同的血清型（和亚型）分布于不同的宿主，疾病状态和地理分布有关[12]。血清型III 是常见的侵袭性菌株，有较强的血脑屏障穿透能力，新生儿晚发型脑膜炎多与其有关；此外，人群中血清型V 患病率的增加可能会对疾病发生率产生影响，通常与成人侵袭性疾病、新生儿脓毒症和孕妇感染有关[13]。在中美洲和东南亚，血清III 型发生率分别为11%和12%；在中国长沙和东莞地区有关报道，血清III 型患病率更高，分别为60%和54.9%；而沈阳地区，最常见的血清型不是血清型III 而是Ia[14]。由于GBS 血清型与侵袭性疾病和疫苗开发的潜在相关性，了解不同地区GBS不同血清型的流行情况，有助于疫苗开发和接种策略的实施。

GBS 是全球新生儿疾病的主要原因，生产时抗生素预防（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）可有效降低GBS 感染产妇不良妊娠结局和新生儿早发型感染发生率，美国疾病预防控制中心（CDC）推荐青霉素作为IAP 的首选药物，但对于青霉素过敏的患者，红霉素和林霉素可作为首选替代药物。然而随着IAP 广泛使用，CLSI-M100 推荐治疗GBS 的抗生素出现多耐药现象。国内一项meta 分析显示，GBS 对青霉素、万古霉素和利奈唑胺出现耐药现象，耐药率分别为1.6%，0.3%和0.3%。国内各地普遍对红霉素有很高的耐药率，东北和华北地区GBS 的红霉素耐药率最高，分别为82.2%和71.5%。克林霉素和左氧氟沙星的耐药性差异较大，克林霉素耐药率最高和最低的地区分别是我国东北地区（74.3%）和华北地区（33.6%），左氧氟沙星耐药率最高和最低的地区是东北地区（67.7%）和华南地区（24.0%）[15]。本文中抗生素敏感度结果显示，所有分离株对青霉素、万古霉素和利奈唑胺完全敏感，尚未出现耐药情况；对红霉素、克林霉素和左氧氟沙星的耐药率分别为 80.0%，74.0%和56.0%，与东北地区耐药率相似；Ⅲ型GBS 对红霉素（87.5%）、克林霉素（83.3%）和左氧氟沙星（54.2%）耐药率最高，Ⅰb 和Ⅰa 型有不同程度的耐药，V型耐药率最低；大环内酯类药物耐药表型测试结果显示，红霉素抗性分离株的耐药表型主要为cMLS型（85.0%）且好发生于Ⅲ型GBS。

携带耐药基因是菌株耐药性的常见原因[16]，GBS 对大环内酯类药物的耐药机制有两种：一是由erm 基因编码的核糖体甲基化修饰介导的耐药；二是通过mef 基因编码的膜蛋白充当外排泵引起的耐药。氟喹诺酮类抗生素作为一种广谱抗生素，其细菌耐药机制有两种：一是gyrA 基因介导的编码DNA 解螺旋酶发生改变影响DNA 复制，二是 parC和parE 基因介导使拓扑异构酶结构发生导致药物结合能力的下降。通过PCR 检测发现，所有M 型耐药株均携带mef（A/E）基因，所有iMLS 分离株均携带ermTR 基因，85.3%的cMLS 型耐药株携带ermB和ermB+mef（A/E）基因，与MOTALLEBIRAD 等[17]研究结果一致。左氧氟沙星耐药分离株中共检测到4 种基因型，以gyrA+partC+ artE 三基因突变为主，表明西安地区，对左氧氟沙星抗性的GBS 菌株耐药机制主要为DNA解螺旋酶和拓扑异构酶的双改变。在我国，氟喹诺酮类药物通常不用于孕妇和新生儿GBS 感染的治疗，但被广泛用于临床、农业和动物饲养，GBS 对喹诺酮类药物的高耐药性可能与环境中细菌对喹诺酮类耐药基因的高携带率有关[18]。因此，监测地区耐药菌流行情况，加强临床抗生素的合理应用，有助于延缓微生物耐药株的出现。

综上所述，西安地区胎膜早破孕妇生殖道GBS以血清型Ⅲ型为主，对二线治疗药物有较高的耐药率。未做体外药物敏感性实验前，红霉素不应再作为替代青霉素的首选药物。因此，GBS 血清型及抗生素耐药性的持续监测，对该菌感染的预防、抗生素的合理应用及相关疫苗的开发提供科学依据。