血清LncRNA MALAT1表达水平对EB病毒感染相关胃癌的诊断和预后价值研究

蔡 梦，阎汉英，王晓静（河北北方学院附属第一医院消化内科，河北张家口 075000）

胃癌（gastric carcinoma，GC）在中国所有恶性肿瘤中的发病率位居第二位[1-2]，是全球癌症死亡的第三大原因[3]。EB 病毒相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC）是一种与EBV感染相关的常见恶性肿瘤。根据地理分布，EBVa-GC 约占所有胃癌的1.3%～30.9%，全球平均占所有胃癌的8.9%，每年约有75 000 例新诊断[4-5]。因此，寻找有效的分子靶点以促进对EBVaGC 患者的诊断及预后非常重要。长链非编码RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）是不编码蛋白质的功能性RNA[6]。新出现的证据表明LncRNA 与GC肿瘤发生和进展密切相关[7]。LncRNA 肺腺癌相关转录物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1，MALAT1）长6.5 kb，最初发现于肺肿瘤组织中[7]。研究表明LncRNA MALAT1 在多种肿瘤组织中呈高表达，包括胃癌组织[9]。但其在EBVaGC患者血清中的表达及其诊断与预后评估价值尚不明确，基于此，本研究通过检测EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 的表达情况，探讨其对EBVaGC疾病的诊断以及预后评估价值，以期为EBV 相关胃癌的诊断、治疗提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年1月～2017年1月河北北方学院附属第一医院消化内科收治的233 例患者为研究对象，采集各组外周静脉血并采用荧光定量PCR 法检测EBV-DNA，并根据EBV DNA 结果将患者分为EBV DNA 阳性组（n=123），男性96例，女性27 例，年龄38～79（62.35±8.59）岁；EBV DNA 阴性组（n=110），男性75 例，女性25例，年龄38～78（61.29±8.21）岁；同时选取在本院进行健康体检的志愿者100 例为对照组，其中男性68 例，女性32 例，年龄38～78（61.95±7.66）岁，三组年龄、性别比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。纳入标准：①所有受试者均经组织病理学确诊；②EBVaGC 患者均为幽门螺旋杆菌阴性；③未接受任何术前治疗；④健康体检人群EB 病毒检测均为阴性。排除标准：①继发性恶性肿瘤；②存在严重的心脏病，如急性心肌梗死、心律失常和心力衰竭；③存在全身性疾病，如肝衰竭、多器官功能障碍综合征和慢性肾病；④临床资料不完整者。研究经过我院道德伦理委员会批准通过，样品采集均获得所有参与者的知情同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：15596026]，Prime Script II 1st Strand cDNA 合成试剂盒（上海百赛生物技术股份有限公司，货号：RR055B），SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司，货号：RR420A），Bio-Rad Real-Time PCR System（美国Applied Biosystems 公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：所有研究对象均于清晨空腹状态下采集静脉血4～5 ml，常规静置30 min，在3 000 r/min 条件下离心10 min，分离提取上层血清，置于低温冰箱中，-80℃保存待测。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中LncRNA MALAT1水平：根据制造商的说明，使用Trizol 提取试剂盒从血清中提取总RNA。用Prime Script II 1st Strand cDNA 合成试剂盒（TaKaRa Bio）对总RNA 进行逆转录合成cDNA。

使用SYBR Premix Ex Taq（TliRNase H Plus；TaKaRa Bio）试剂盒在Bio-Rad Real-Time PCR System（Bio-Rad，美国）上进行qRT-PCR 测定。PCR反应条件为：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，40 个循环。以GAPDH 为内参基因，采用2-ΔΔCt方法对血清中LncRNA MALAT1 表达水平进行相对定量分析。PCR 引物序列: LncRNA MALAT1 正向引物5’- TGGGATGGTCTTAACAGGGA-3’,反向引物5’-CCTGAAGGTGTTCGTGCCAA-3’,GAPDH 正向引物5’- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,反向引物5’- AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.3.3 随访：每3 个月以门诊或电话的形式进行一次定期随访，询问记录患者的生存时间，随访开始时间从出院起计算，随访时间为5年，截止时间为2022年1月，终点事件定义为患者死亡。

1.4 统计学分析 通过SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料经正态分布和方差齐性检验后表示为均数±标准差（±s），组间比较行t检验；计数资料表示为n，组间比较采用χ2检验，多组数据比较利用单因素方差分析，进一步两两比较进行SNK-Q分析；利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价LncRNA MALAT1水平对EBVaGC 的预测价值；Kaplan-Meier 法分析不同LncRNA MALAT1 表达水平与患者生存时间的关系，并绘制生存曲线；多因素COX 回归风险模型分析EBVaGC 患者的预后影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 的表达 研究结果显示EBV DNA 阳性组EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表达水平（1.27±0.03）高于EBV DNA 阴性组患者（1.12±0.05）和健康对照组（0.96±0.04），差异具有统计学意义（F=1 620.239，P＜0.05）。

2.2 血清中LncRNA MALAT1 表达与EBVaGC 患者临床病理参数的相关性研究 见表1。LncRNA MALAT1 在EBVaGC 患者血清中的表达与患者年龄、主癌位置、脉管癌栓、肿瘤直径、肿瘤组织学类型、神经侵犯、浸润深度无关（均P＞0.05），与性别、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期、Lauren 分型有关（均P＜0.05）。

表1 EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表达与临床病理参数的相关性（n=123,±s）

表1 EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表达与临床病理参数的相关性（n=123,±s）

类 别 nLncRNA MALAT1 相对表达量t/FP性别男961.28±0.046.2650.000女271.23±0.02年龄（岁）＞50581.28±0.051.4850.140≤50651.27±0.02主癌位置胃食管结合部141.26±0.02 1.3200.271胃底、胃体391.27±0.03胃窦641.27±0.03全胃、残胃61.29±0.06分化程度低分化871.31±0.0417.1070.000中+高分化361.19±0.02淋巴结转移是711.30±0.0312.7840.000否521.23±0.03 TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期331.12±0.0129.7480.000Ⅲ+Ⅳ期901.33±0.04脉管癌栓有741.27±0.021.5460.125无491.28±0.05肿瘤直径（cm）＜5.5481.27±0.031.8030.074≥5.5751.28±0.03肿瘤组织学类型伴淋巴样间质癌51.29±0.021.4740.143非伴淋巴样间质癌1181.27±0.03 Lauren 分型肠型211.25±0.02弥漫型451.28±0.03混合型321.27±0.02未分型251.28±0.05神经侵犯有641.28±0.041.7310.086无591.27±0.02浸润深度＜T2111.29±0.051.9700.051≥T21121.27±0.03 4.8800.003

2.3 LncRNA MALAT1 对EBVaGC 患者的诊断价值分析 见图1。以EBV DNA 阳性为因变量，以LncRNA MALAT1 表达水平为自变量进行ROC 曲线分析，结果显示，LncRNA MALAT1 预测EBVa-GC 患者的AUC 为0.863（95%CI：0.811～0.906），截断值为：＞1.21，对应的敏感度为92.68%，特异度为81.00%。

图1 血清LncRNA MALAT1 水平对EBVaGC诊断价值的ROC 曲线

2.4 EBVaGC 患者血清LncRNA MALAT1 水平与预后的关系 随访过程中无失访病例，随访期间生存56 例，LncRNA MALAT1 以中位数为临界值，超出该范围判定为高表达，低于该范围定义为低表达。其中高表达者共78 例，低表达者45 例。

绘制五年生存曲线，Kaplan-Meier 分析结果显示，LncRNA MALAT1 高表达组患者五年累积生存率34.62%（27/78），平均生存时间36.84±19.40个月，显著低于低表达组57.78%（26/45），平均生存时间46.35±18.18 个月，差异有统计学意义（Log rankχ2=6.944，P=0.008）。见图2。

图2 EBVaGC 患者血清LncRNA MALAT1 水平与预后的关系

2.5 影响EBVaGC 患者预后的单因素和多因素COX 回归分析 见表2。以EBVaGC 患者是否死亡为因变量（未死亡=0，死亡=1），以年龄、主癌位置、脉管癌栓、肿瘤直径、肿瘤组织学类型、神经侵犯、浸润深度、性别、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期、Lauren 分型为自变量进行单因素分析，结果显示年龄、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期、Lauren 分型、LncRNA MALAT1 均与EBVaGC 患者预后相关（P＜0.05）。进一步行多因素COX 回归分析，年龄（＞50=1，≤50=0）、分化程度（G2/G3=0，G1=1）、淋巴结转移（无=0，有=1）、TNM 分期（Ⅰ+Ⅱ=0，Ⅲ+Ⅳ=1）、Lauren 分型（其他=0，弥漫型=1）、LncRNA MALAT1（低表达=0，高表达=1）为自变量，结果显示年龄、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期、LncRNA MALAT1 高表达均是影响EBVaGC 患者生存状况的独立危险因素（P＜0.05），见表3。

表2 影响EBVaGC 患者预后的单因素分析（±s）

表2 影响EBVaGC 患者预后的单因素分析（±s）

死亡（例）类别n t/FP是否n=56性别男96 50461.006 0.316女27 1710年龄（岁）＞5058 203817.682 0.000≤5065 4718主癌位置胃食管结合部1486 0.330 0.954 n=67胃底、胃体39 2019胃窦64 3628全胃、残胃633分化程度低分化87 41466.466 0.011中+高分化36 2610淋巴结转移是71 264521.581 0.000否52 4111 TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期33 2588.240 0.004Ⅲ+Ⅳ期90 4248脉管癌栓有74 40340.013 0.909无49 2722肿瘤直径（cm）＜5.548 30182.046 0.153≥5.575 3738肿瘤组织学类型 伴淋巴样间质癌5230.440 0.507非伴淋巴样间质癌 118 6553 Lauren 分型肠型21 156 8.084 0.044弥漫型45 1827混合型32 1815未分型25 178神经侵犯有64 39250.158 0.691无59 3821浸润深度＜T211560.396 0.529≥T2112 6250 LncRNA MALAT1 高表达63 41225.860 0.015低表达60 2634

表3 影响EBVaGC 患者预后的COX 回归分析

3 讨论

EBV 是一种双链DNA 病毒，是第一个被发现与多种人类癌症相关的病毒，包括淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌（EBVaGC）等[10-11]。其中EBVaGC 每年的发病率为75 000～90 000 例，是EBV 相关肿瘤中最大的亚群，其中位生存期仅为8.5年[12]。但目前EBVaGC 的发病机制尚不明确，部分EBVaGC 患者难以被准确诊断，预后较差，因此急需选择有效可靠的指标评估EBVaGC 患者疾病及预后。

LncRNA 在免疫反应、血管生成、细胞增殖、凋亡、自噬、细胞迁移和侵袭等多种生物学过程中发挥着重要的作用[13]。多项研究表明，LncRNA 也可以调节和被肿瘤免疫微环境调控，使LncRNA 成为潜在的生物标志物和治疗靶点，从而可以改善GC 的管理和治疗。例如，血浆LncRNA H19 已在GC 中得到鉴定，可作为GC 诊断的潜在生物标志物[13]。已证明位于染色体11q13 上的MALAT1 与各种类型的肿瘤有关[15]。据报道LncRNA MALAT1在多种癌症中过表达，并调节癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[16]。最近的研究表明，LncRNA MALAT1 通过激活自噬，在胶质瘤和卵巢癌中促进增殖和侵袭[17-18]。此外，LncRNA MALAT1 通过调节肝细胞癌、弥漫性大B 细胞淋巴瘤和GC 中的自噬来调节化疗耐药性[18，20]。在本研究中，EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表达较EBV DNA 阴性胃癌患者及健康人群中均明显升高，表明LncRNA MALAT1 可能在EBVaGC 疾病中发挥促癌基因的重要作用，分析其原因可能是LncRNA MALAT1 通过多种调控因子及途径影响下游基因表达，进一步促进肿瘤的发生、发展，但其具体机制还需进一步研究。研究进一步通过相关性分析可知，LncRNA MALAT1 表达与性别、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期、Lauren 分型有关，且随着肿瘤分期升高，LncRNA MALAT1 表达水平越高，表明LncRNA MALAT1 的高表达可促进EBVaGC 相关胃癌进展，与肿瘤转移、增殖等关系密切，可能作为临床判断EBVaGC 疾病进展的血清学指标，从而为临床EBVaGC 的筛查、诊断、治疗提供可靠的病理学依据；根据ROC 结果发现LncRNA MALAT1 对诊断EBVaGC 疾病有较好的敏感度和特异度，表明LncRNA MALAT1 可能作为诊断该疾病的潜在标志物。经过绘制生存曲线结果显示LncRNA MALAT1高表达患者五年累积生存率显著低于低表达患者，推测LncRNA MALAT1 是评估EBVaGC 胃癌患者不良预后的生物标志物，提示LncRNA MALAT1可在一定程度反映EBVaGC 胃癌患者生存期，可为临床评估预后提供有效信息，此外其表达升高不利于患者生存预后也提示临床可通过降低LncRNA MALAT1 表达水平，降低EBVaGC 患者不良预后发生率，提高生存率；研究发现年龄、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期、LncRNA MALAT1 高表达均是影响EBVaGC 患者生存状况的危险因素，有望成为EBVaGC 患者预后预测的无创生物标志物，提示临床LncRNA MALAT1 高表达的患者，可以在手术后进行严密的随访及观察，在必要的时候给予患者恰当的辅助治疗，以期改善患者的预后。上述结果可能为LncRNA MALAT1 参与EBVaGC 的发生提供依据，但本研究只分析了血清中LncRNA MALAT1 表达单独诊断EBVaGC 的价值，后续研究可进一步分析其与肿瘤标志物联合检测对EBVa-GC 的诊断价值，更多作用机制尚需深入研究。

综上所述，EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1呈高表达与EBVaGC 患者临床特征密切相关，可作为EBVaGC 胃癌患者预后不良的生物标志物，为EBVaGC 的致病机制研究提供新思路，对临床诊断EBVaGC 和评估生存预后具有重要价值。