急性缺血性脑卒中小鼠模型脑组织中miR-21表达对炎症反应和细胞凋亡的影响及相关机制研究

刘高雯，段 颖（咸阳市中心医院重症医学科，陕西咸阳 712000）

脑卒中是一种急性脑血管病，分为缺血性和出血性两种，不仅发病率、致残率高，复发率和死亡率也较高，其中缺血性脑卒中约占全部脑卒中的80%以上，严重影响人类生命健康[1]。目前，急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)的治疗包括降颅压治疗、溶栓治疗、抗凝治疗及支架植入等，但临床治疗效果均不尽人意，有学者指出可能是缺乏对急性脑卒中损伤后脑内细胞分子机制的深入探讨，未能做到针对性治疗[2-3]。近年随着分子生物学的快速发展，缺血性脑卒中后内环境变化及病理机制的研究已成为科研工作者研究的热点。有研究报道，脑卒中后诱导的炎症反应使得大量吞噬细胞在缺血区域不断浸润，加剧了神经细胞凋亡，造成了脑组织的二次损伤[4]。因此，寻找具有调节脑缺血后促炎因子和抗炎因子表达平衡的特异性分子，可为治疗急性缺血性脑卒中提供新的方法。miR-21 作为具有调控作用的非编码微小RNA，已被证实在心脑血管疾病中可以靶向调节炎症反应，发挥神经保护作用[5]。研究发现，Toll 样受体4(toll-like receptor-4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的激活会活化下游NOD 样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体，诱导机体产生免疫应答，从而建立脑内炎性环境，造成神经损伤[6]。基于上述研究，猜测miR-21 可能通过调控TLR4/NFκB/ NLRP3 通路改善急性缺血性脑卒中后炎症反应，但需研究证实。本研究拟通过建立短暂局灶性大脑中动脉闭塞（tran-sient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠模型，探讨了miR-21 过表达对小鼠炎症反应及细胞凋亡的影响及可能作用机制，期望为急性缺血性脑卒中的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 30 只雄性C57/BL6 小鼠，SPF 级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证SCXK（京）2020-0014]，体质量20±5g，饲养温度22±3℃，湿度55%±5%，12h 昼夜周期，标准喂养条件下适应性饲养一周，每笼2 只，自由饮水和摄食。将30 只小鼠随机分为假手术组、tMCAO模型组和miR-21 agomir 激动剂预处理组，每组10只。本研究符合实验动物使用及保护条例，并经本院伦理委员会审核批准（批号20210342）。

1.2 仪器与试剂 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司）；酶联免疫试剂盒，PCR 逆转录试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；PCR 引物合成（上海生工生物工程公司）；RIPA 裂解液，BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗鼠NLRP3，TLR4,NFκB，Bax，Bcl-2 抗体及辣根标记山羊抗兔IgG 抗体（北京中杉金桥有限公司）；PCR 仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；凝胶成像仪（美国BioTek 公司）；miR-21 agomir 激动剂（广州锐博生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型构建及分组：所有小鼠禁食禁水12 h，采用颈内动脉栓线法构建tMCAO 模型。具体方法：60 mg/kg 戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，取俯卧位固定，颈部消毒于正中间切1.5 cm 左右小口，分离皮下组织、腺体及肌肉，暴露右侧颈部总动脉及颈内动脉，顺着总动脉继续游离，暴露颈外动脉，分离动脉周围组织，结扎总动脉及颈内动脉并阻断血流，在颈外动脉两端打结，在两结之间剪一小口，插入线栓，提拉颈外动脉，使线栓缓慢进入颈内动脉约10 mm 左右遇轻微阻力即停止进入，固定线栓，逐层缝合切口，碘伏消毒防止感染，缺血90 min 后拔出线栓，恢复脑血流，48 h 后即可进行后续实验。假手术组与tMCAO 操作相同，但线栓只进入5 mm 左右，未造成小鼠大脑缺血；miR-21 agomir 组小鼠行tMCAO 手术后，侧脑室注射miR-21 agomir激动剂。

1.3.2 实施荧光定量PCR 检测脑组织中miR-21 表达：取各组小鼠脑组织，剪碎冰上研磨至匀浆后加入Trizol 裂解液，提取组织总RNA，紫外分光光度仪检测其纯度；反转录合成cDNA 并以此为模板，行实时定量PCR 分析。反应体系：20 μl，95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，循环40 次。miR-21引物：上游5’-GTCGAGACTCATGTGGC-3’，下游5’-GCGGTTAGCATCACGGT-3’；内参U6：上游5’-CTGCCTTACGTGACATC-3’，下游5’-AAGC TAAGCGGAACGGT-3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，实验重复三次取平均值。

1.3.3 mNSS 评估神经功能：tMCAO 手术48h 后，观察各组小鼠死亡情况，根据改良神经严重程度评分（modified neurological severityscore，mNSS），总分0～18，从运动、感觉、反射及平衡等方面评估各组小鼠神经功能损伤程度，分值越高代表损伤越严重。由两位人员进行评分取平均值。

1.3.4 TTC 测定脑梗死体积：tMCAO 手术48h 后，慢慢分离颅底组织得到完整的脑组织，并将其放于模具上，切成4 片冠状切片，每片厚约2 mm，将脑片浸于TTC 溶液中，37℃恒温孵育30 min，取出脑片用多聚甲醛固定24h，用扫描仪扫描成像，正常脑组织为红色区域，缺血脑组织为白色区域，脑梗死体积采用Image J 软件测量。

1.3.5 酶联免疫吸附法检测炎症因子水平：取各组小鼠缺血脑组织，裂解、匀浆处理后，离心取上清，根据试剂盒说明书分别测定TNF-α，IL-10，TGF-β1 和IL-18 水平。

1.3.6 Tunel 染色观察神经细胞凋亡情况：取各组小鼠脑组织制备成冰冻切片，用5%(v/v) Donkey 血清封闭2h，PBS 洗2 次，加入配制的Rabbit-antimouse NeuN（1∶500），4℃过夜孵育；次日取出，PBS 洗三次，在孵育盒中加入配制的Donkey-anti-Rabbit cy3/594（1∶1 000），室温孵育2 h，PBS 洗三次，加入Tunel染液，37℃ 暗盒孵育1 h，终止反应，DAPI 甘油封片液封片，显微镜下观察。

1.3.7 蛋白免疫印迹实验检测炎症相关蛋白及凋亡蛋白：tMCAO 术后48 h，取小鼠缺血脑组织，裂解、匀浆处理提取总蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度。取20 µg 蛋白样品进行凝胶电泳，设置 80 V 电压至蛋白样品跑至分离胶，调节电压为160 V，直至条带跑至分离胶底部，取出分离胶带进行聚偏氟乙烯转膜后，5%（v/v） 脱脂牛奶封闭1 h，加入待测蛋白一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日加入二抗，室温孵育 1 h，使用 Image J 软件分析条带灰度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件分析数据，所有实验数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；两组间比较采用独立样本t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 tMCAO 小鼠脑组织中miR-21 表达情况 假手术组小鼠脑组织中miR-21 相对表达为0.83±0.17，经tMCAO 手术造模后，模型组脑组织中miR-21相对表达显著下降为0.50±0.11，两组间差异有统计学意义（t=21.370，P＜0.05）；miR-21 agomir 组小鼠侧脑室注射miR-21 agomir 激动剂后，miR-21相对表达为1.55±0.32，三组间比较差异有统计学意义（F=43.805，P＜0.05），提示脑内miR-21 过表达tMCAO 小鼠构建成功。

2.2 miR-21 过表达对神经功能的影响 假手术组小鼠术后无死亡，进食饮水正常，呼吸平稳，可正常行走运动，mNSS 评分为0 分。tMCAO 组小鼠术后48 h死亡率为30%，术后苏醒时间较长，精神萎靡，反应能力下降，且出现了不同程度的右侧肢体偏瘫，mNSS 评分为11.30±3.42 分，显著高于假手术组，差异有统计学意义（t=17.195，P＜0.05）；miR-21 agomir组小鼠术后48 h死亡率为20 %，其饮食状况、精神状态、反应能力等均较tMCAO 组有所改善，mNSS 评分为5.61±1.73 分，与tMCAO 组比较差异有统计学意义（t=12.784，P＜0.05）。说明miR-21 过表达能减轻缺血性脑卒中后小鼠的神经症状，降低其神经功能评分。

2.3 miR-21 过表达对脑梗死的影响 见图1。各组小鼠脑组织TTC 染色。假手术组小鼠脑组织呈均匀的红色，无脑梗死；tMCAO 组小鼠脑组织呈现大面积的白色区域，经计算其脑梗死体积约为62.72%±5.30%；侧脑室注射miR-21 agomir 激动剂组小鼠脑组织白色区域面积较tMCAO 组明显减少，其梗死体积约为38.22%±3.31%，两组间比较差异有统计学意义（t=31.309，P＜0.05），提示miR-21过表达能够减少缺血性脑卒中后脑梗死体积。

图1 各组脑组织TTC 脑梗死面积染色

2.4 miR-21 过表达对炎症因子水平的影响 见表1。与假手术组相比，tMCAO 组小鼠脑组织中促炎因子TNF-α 和IL-18 水平明显升高，差异均有统计学意义（t=9.458，7.777，均P＜0.05），而抗炎因子TGF-β1 和IL-10 水平稍有升高，但差异无统计学意义（t=0.771，0.739，均P＞0.05）；与tMCAO 组比较，注射miR-21 agomir 激动剂组TNF-α 和IL-18 明显下降，TGF-β1 和IL-10 明显升高，差异有统计学意义（t=4.144，4.868，9.693，3.785，均P＜0.05），提示miR-21 过表达能够调节缺血性脑卒中后促炎因子和抗炎因子之间的平衡。

表1 miR-21 过表达对tMCAO 小鼠脑组织中炎症因子水平的影响（±s，pg/ml）

表1 miR-21 过表达对tMCAO 小鼠脑组织中炎症因子水平的影响（±s，pg/ml）

项目假手术组tMCAO 组miR-21 agomir 组F 值P 值TNF-α230.26±27.31369.07±33.50305.19±29.4445.695＜0.001 TGF-β175.38±10.4281.16±9.72157.45±22.5074.988＜0.001 IL-1098.38±9.10103.26±13.45129.50±17.3913.119＜0.001 IL-1846.51±6.1290.26±15.4861.50±12.4930.432＜0.001

2.5 miR-21 过表达对细胞凋亡的影响 见图2。Tunel 染色观察显示，假手术组小鼠脑组织皮层细胞形态结构正常，出现少量染色阳性细胞凋亡，其凋亡数约为9.40±5.21 个，而tMCAO 组小鼠脑组织中细胞体积变小、细胞核固缩、细胞质浓缩，梗死周边区皮层细胞凋亡明显，其凋亡数约为75.52±12.81 个，两组比较差异有统计学意义（t=38.552，P＜0.05），注射miR-21 agomir 激动剂后，皮层细胞凋亡情况显著改善，其凋亡数约为42.41±9.62 个，与tMCAO 组比较差异有统计学意义（t=19.174，P＜0.05），提示miR-21 过表达可明显抑制缺血性脑卒中后皮层细胞的凋亡，具有脑损伤保护作用。

图2 Tunel 染色观察各组小鼠脑组织皮层细胞凋亡分布（×400）

2.6 miR-21 过表达对TLR4/ NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响 见图3，表2。tMCAO 组小鼠脑组织中通路相关蛋白TLR4,p-NFκB，NF-κB 和NLRP3 表达水平较假手术组明显上调，凋亡蛋白Bcl-2/Bax 比值则明显下调，差异均有统计学意义（t=7.049，4.767，2.790，6.453，5.089，均P＜0.05）；与tMCAO 组相比，注射miR-21 agomir 激动剂组，小鼠脑组织中TLR4，p-NF-κB，NF-κB 和NLRP3 表达显著下调，而Bcl-2/Bax 比值明显上调，差异有统计学意义（t=3.098，2.774，2.314，2.954，2.217，均P＜0.05）；提示miR-21过表达可能通过调控TLR4/ NF-κB/NLRP3 信号通路活性，改善脑组织细胞凋亡。

表2 miR-21 过表达对TLR4/ NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响（±s）

表2 miR-21 过表达对TLR4/ NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响（±s）

类 别假手术组 tMCAO 组 miR-21 agomir 组 F 值P 值TLR40.39±0.08 0.78±0.150.60±0.1125.371＜0.001 NF-κB 0.54±0.09 0.90±0.210.68±0.1611.369＜0.001 p-NF-κB 0.67±0.14 0.98±0.290.71±0.254.303 0.026 NLRP3 0.22±0.07 0.74±0.230.49±0.1821.136＜0.001 Bcl-2/Bax 1.20±0.28 0.61±0.170.88±0.2213.239＜0.001

图3 Westernblot 检测TLR4/ NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白及凋亡蛋白表达

3 讨论

据统计，我国每年约有240 万人新发脑卒中，每年约110 万人死于脑卒中，其已经成为居民死亡的第一位原因，是我国人民群众健康的第一大杀手[7]。因此，针对脑卒中的治疗和康复是医学界面临的难题之一。近年研究发现，miRNAs 与心脑血管病的发生有关，冠心病、心肌病、缺血性心脏病及脑卒中等多种疾病中常伴有miRNAs 差异表达，提示其在脑血管疾病的发生发展中发挥重要作用[8]。脑卒中动物实验模型研究也发现了多个miRNA 的异常表达，如既往文全庆等[9]研究发现，脑缺血大鼠模型术后1h 皮质脑组织中有35 个miRNA 表达上调，89 个表达下调。高法梁等[10]研究表明，大脑中动脉阻塞模型大鼠脑缺血皮质区miR-210 表达较正常组显著上调。人脑卒中研究中发现，多个miRNAs的多态性与缺血性脑卒中发病机理相关[11]。因此，积极探究miRNA 与脑卒中的关系，找寻新的特异性miRNA 标志，具有重要临床意义。

研究发现，miR-21 是脑血管疾病中特异性表达最为显著的miRNA[12-13]。TU 等[14]通过微阵列分析检测发现，缺血性小鼠脑组织中miR-21 表达可以改善脑组织结构，抑制神经元细胞凋亡，减少脑梗死面积。YAO 等[15]在小鼠缺血性再灌注损伤的研究中发现，miR-21 过表达降低了血清中IL-1β，TNF-α 和IL-6 等炎症因子水平，减轻心肌组织病理改变，减少心肌细胞凋亡，可能为脑缺血的治疗开辟一条新的治疗途径。YAN 等[16]研究则表明，miR-21 在体内和体外缺血模型中均表达下调，过表达可以显著抑制缺血后p53/Bax/Bcl-2 之间的信号传导，减少神经元死亡、防止缺血性损伤，从而改善神经功能。故miR-21 在缺血性脑卒中的研究值得注意，有望成为临床治疗的新靶点。本研究结果显示，相比假手术组，tMCAO 组小鼠脑组织中miR-21 表达明显下降，说明miR-21 可能在缺血脑损伤发生、发展过程中发挥重要作用。诱导miR-21 过表达后，小鼠神经功能评分降低，脑梗死体积减少，神经细胞凋亡抑制，推断miR-21 过表达能够改善缺血性脑卒中后的脑神经功能损伤，与上述文献报道结果相一致。大量研究表明，缺血性脑卒中的发生与神经炎症的关系密切，认为缺血性脑卒中后脑内产生的炎症反应会加速缺血性损伤的形成，影响神经元死亡及神经组织再生[17]。缺血性脑卒中导致脑组织缺血，会引起神经元细胞不能正常维持跨膜离子梯度及平衡，导致细胞凋亡及炎症和氧化应激的发生[18]。此外目前主流观点认为，NLRP3 炎症小体可产生促炎因子，介导脑水肿和神经细胞功能障碍的发生，其一旦激活可诱导缺血性脑卒中的神经炎症，导致神经细胞死亡越来越多。研究表明炎症小体与缺血性脑卒中发病密切，其参与介导炎症反应的相关调节机制及其与脑卒中之间的关系，以成为当前研究的热点[19]。本研究发现，tMCAO 组促炎因子水平明显升高，推断缺血损伤后可能诱导促炎因子释放和炎性细胞浸润，加剧了炎症反应；诱导miR-21过表达后促炎因子水平逆转，抗炎因子水平持续增加，这与ZHOU 等[20]报道的结论相一致，miR-21为缺血性脑卒中后续研究及治疗提供了新的方向和靶点。

TLR4/NF-κB 途径是近年来发现与抗炎免疫机制密切相关的信号通路，据报道，机体受损伤后的炎症反应会激活该信号途径，诱导NLRP3 炎症小体表达[21-22]。抑制TLR4/NF-kB/NLRP3 通路介导的抗炎途径后，小鼠缺血性损伤明显减轻[23]。且有研究表明，HMGB1/TLR4 轴是神经炎症的重要启动子，与神经炎症及创伤性脑损伤等发生有关，TLR4 调控下游NF-κB 可促进炎性细胞因子产生，加速疾病发生[24]。葛根素通过调控TLR4/Myd88/NF-κB 通路可抑制NLRP3 炎症小体激活，改善大鼠心肌缺血再灌注损伤[25]。奥美汀通过抑制NF-κB 表达能够减少神经元凋亡和神经炎症[26]。红景天苷通过抑制NLRP3 炎症小体活化可缓解局部炎症，对MCAO 大鼠起到保护作用[27]。上调miR-21 表达可以抑制TLR4/NF-κB 通路，抑制神经元凋亡和ROS 的产生，发挥神经损伤保护作用[28]。本研究经探究miR-21 对TLR4/NF-κB/NLRP3 信号通路相关蛋白及凋亡蛋白的影响，发现tMCAO 组脑组织中通路相关蛋白表达明显升高，凋亡蛋白表达明显降低；注射miR-21 激动剂后，各蛋白水平发生逆转，提示TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路可能参与了miR-21 对缺血性脑损伤的改善作用，可作为缺血性脑卒中临床治疗的靶向途径。然而本研究未构建注射miR-21 抑制剂敲低表达模型进一步验证miR-21 对脑卒中后炎症反应、细胞凋亡的影响及对TLR4/NF-KB/NLRP3 通路的调控作用；其次研究目前仅处于基础实验探索阶段，由于脑内细胞变化的复杂性及miRNA 调控通路的多样性，miR-21 与TLR4/NF-kB/NLRP3 之间的靶向关系后期还需通过微阵列分析探讨，并结合细胞实验进一步探讨TLR4/NF-kB/NLRP3 途径与小胶质细胞炎症反应的关系，以期提供更有力的依据。

综上所述，急性缺血性脑卒中小鼠脑组织中miR-21 表达明显下降，其过表达可以调节脑缺血后促炎因子和抗炎因子之间的平衡，改善皮层细胞凋亡，可能是通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路发挥脑损伤保护作用，为急性缺血性脑损伤的治疗提供了新方向。