弥漫大B细胞淋巴瘤患者病理组织中IQGAP2和CDC42表达及临床价值研究

陈铁桥，易小明，王 云，王明明，张雨相（.湖南中医药高等专科学校附属第一医院/湖南省直中医医院检验科，湖南株洲 4000；.岳阳市中医医院检验科，湖南岳阳 440）

弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤[1]。DLBCL 的临床治疗以利妥昔单抗与环磷酰胺、阿霉素、长春新碱及泼尼松联合化疗方案为主，但DLBCL 是一种异质性肿瘤，部分患者仍可发生进展，导致不良预后[2]。含有IQ 基序的GTPase 激活蛋白2（IQ motif containing GTPase activating protein 2，IQGAP2）包含钙调蛋白结构域，参与细胞黏附、细胞骨架重排及细胞内信号传导[3]。近年来发现，在乳腺癌[4]、前列腺癌[5]等恶性肿瘤中异常表达上调，其通过促进肿瘤细胞的增殖和转移，促进肿瘤的发生发展。细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，CDC42)是Rho 家族成员，参与调控细胞形态、迁移及内吞等多种生理过程。研究表明，乳腺癌[6]、胃癌[7]等恶性肿瘤中CDC42 异常表达上调，其促进肿瘤细胞G2 期向S 期转换，导致肿瘤细胞过度增殖。目前DLBCL 中IQGAP2，CDC42 的表达及临床意义报道较少。本研究通过检测DLBCL 中IQGAP2，CDC42 的表达，探讨二者的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年2月～2019年2月期间湖南省直中医医院诊治的83 例初诊DLBCL 患者为DLBCL 组。纳入标准：①年龄≥18 岁；②经病理组织学检查明确诊断为DLBCL；③临床和随访资料完整。排除标准：①并发自身免疫性疾病、急性感染性疾病等；②并发其它恶性肿瘤；③并发凝血功能障碍等疾病。其中男性43 例，女性40例；年龄31～80（55.19±4.24）岁；Hans 标准分型：生发中心B 细胞型（germinal center B cell like,GCB）33 例，非GCB 型50 例；Ann Arbor 临床分期：I～Ⅱ期35 例，Ⅲ～Ⅳ期48 例；B 症状：有44 例，无39 例；国际预后指数（international prognostic index,IPI）评分：0～2 分33 例，3～5 分50 例；伴有结外侵犯54 例；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）≥245 U/L 41 例，＜ 245 U/L 42 例。选取同期反应性淋巴结增生（reactive lymph node hyperplasia，RHL）患者50 例为RLH 组，其中男性28 例，女性22 例；年龄29～84（53.14±4.63）岁。两组在性别、年龄之间差异无统计学意义（χ2=0.220,t=1.794,均P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会批准，所有研究对象已签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 石蜡切片机（德国徕卡公司，型号RM2016），光学显微镜（日本Olympus 公司，型号CX23），两步法免疫组化染色试剂盒（上海塞维尔生物公司，货号G1216）。IQGAP2，CDC42单克隆抗体（美国Abcam 公司，货号ab187153，ab41429），彩色预染蛋白、化学发光试剂（北京酷来博科技公司），RIPA 细胞裂解液（碧云天生物公司），GeneSens2100 凝胶成像分析系统（上海勤翔公司），ECLIPSE Ci-L 型光学显微镜（日本Nikon公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法：均接受6～8 个周期的R-CHOP化疗方案。第一天予以利妥昔单抗（美罗华,上海罗氏制药有限公司，批号：SH0051）静脉滴注，375 mg/m2。第二天予以环磷酰胺（山西泰盛制药有限公司，批号：0901311）750 mg/m2＋多柔比星（广东岭南制药有限公司，批号：H20063155）50 mg/m2+长春新碱（辽宁卫星制药厂，批号：H20068151）1.4 mg/m2，泼尼松（华中药业公司，批号：H42021394）100 mg/m2。第3～6 天继续予以泼尼松100 mg/m2。三周为一周期，6～8 周期，化疗结束后进行疗效评估。

1.3.2 疗效评估：根据非霍奇金淋巴瘤疗效评价标准对化疗疗效进行评价[8]，完全缓解（complete remission,CR）：病灶完全消失，维持时间≥4 周。CR 率为CR/总例数×100%。

1.3.3 标本采集及IQGAP2，CDC42 蛋白检测：标本采集：留取DLBCL 患者淋巴瘤病理组织及反应性淋巴结增生组织（经组织病理学检查明确诊断）约50mg，置于10g/dl 的福尔马林中固定过夜。采用免疫组织化学法检测组织中IQGAP2，CDC42蛋白表达。组织常规石蜡包埋切片，按照常规步骤进行免疫组化染色。封片后镜检，进行染色强度评分（0：无染色，1：浅黄色，2：棕褐色）和染色面积评分（0：≤25%，1：25%～50%，2：≥50%），两者乘积＜2 分为阴性，≥2 分为阳性。

1.3.4 免疫印迹检测IQGAP2，CDC42 蛋白表达：取DLBCL 及RLH 组织约50mg，液氮中研磨，加入RIPA 裂解液冰上裂解30min，离心取上清。金属浴100℃15min 蛋白变性。每孔25mg 蛋白量上样，浓缩胶80V，30min，分离胶110V，90min。湿转法90V 转膜90min。5g/dl 脱脂奶封闭2h。一抗4℃孵育过夜（稀释比均为1 ∶2 000），二抗室温孵育1h。用化学发光法显影，凝胶成像软件扫描条带灰度。以GAPDH 作为内参，计算各蛋白条带的相对灰度值，表示蛋白的相对表达量。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0 软件进行数据分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用卡方检验。生存分析采用Kaplan-Meier 分析（Log-Rank 检验）。单因素及多因素COX 回归分析影响DLBCL 患者预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组IQGAP2，CDC42 蛋白表达比较 免疫组织化学结果见图1。DLBCL 中IQGAP2 蛋白阳性染色主要位于细胞膜和细胞浆，CDC42 蛋白主要位于细胞核和细胞浆。DLBCL组中IQGAP2，CDC42蛋白阳性率分别为83.13%（69/83）和85.54%（71/83），高于RLH 组的8.00%（4/50）和12.00%（6/50），差异有统计学意义（χ2=57.016，69.230，均P=0.000）。免疫印迹结果见图2。DLBCL组织中IQGAP2，CDC42蛋白相对表达量分别为1.21±0.23，1.34±0.25，高于RLH 组织的0.61±0.18，0.75±0.21，差异具有统计学意义（t=15.759，14.377，均P=0.000）。

图1 免疫组化检测组织中IQGAP2，CDC42 蛋白表达（200×）

图2 免疫印迹检测组织中IQGAP2，CDC42 蛋白表达

2.2 IQGAP2，CDC42 表达与DLBCL 组患者临床病理特征的关系 见表1。Hans 分型非GCB 型、Ann Arbor 临床分期Ⅲ～Ⅳ期组织中IQGAP2，CDC42 蛋白阳性率大于GCB 型，Ⅰ～Ⅱ期，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 IQGAP2，CDC42 表达与DLBCL 组患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 IQGAP2，CDC42 表达与DLBCL 患者短期化疗疗效及预后的关系 见表2，图3。本研究中，83 例DLBCL 中，CR 者47 例。IQGAP2，CDC42阳性表达组CR 率明显低于IQGAP2，CDC42 阴性表达组（均P＜0.05）。随访过程中，死亡31 例，失访1 例。IQGAP2，CDC42 阳性表达组三年总体生存率均明显低于IQGAP2，CDC42 阴性表达组患者（均P＜0.05）。

表2 IQGAP2，CDC42 表达与DLBCL 患者短期化疗疗效及预后的关系[%（n）]

图3 IQGAP2，CDC42 蛋白表达对DLBCL 患者预后的影响

2.5 单因素及多因素COX 回归分析影响DLBCL预后的因素 见表3，4。以DLBCL 患者的生存预后为因变量（1=死亡，0=存活，t=时间），进行单因素及多因素COX 分析，结果Ann Arbor 分期Ⅲ～Ⅳ期、IQGAP2 阳性、CDC42 阳性是影响DLBCL 患者生存预后的独立危险因素。

表3 单因素COX 比例风险回归模型

表4 多因素COX 比例风险回归模型

3 讨论

DLBCL 属于B 细胞淋巴瘤，中老年人群多见，主要表现为快速增大的淋巴结，结外肿块及全身症状，特点为高侵袭性、强异质性，往往导致正常淋巴结结构的弥漫性破坏[9]。DLBCL治疗以化疗为主，近年来随着新的治疗方法的出现，很多患者得到长期持续缓解，但由于DLBCL 是恶性程度较高的肿瘤，仍有30%～40%的患者出现肿瘤复发、难治和肿瘤进展[3,10]。深入研究DLBCL 的疾病机制，寻找能够评估化疗疗效及预测临床生存预后的肿瘤标志物，具有重要的临床意义。

IQGAP2 是一种GTP 酶活化蛋白，结构上包含IQ结构域及多聚脯氨酸结构域，参与细胞骨架重构、胞质分裂和恶性肿瘤等病理生理学过程[11-12]。本研究中，DLBCL 中IQGAP2 蛋白表达升高，与不良临床病理特征有关，提示IQGAP2 参与DLBCL 的肿瘤发生发展。既往研究发现，DLBCL 中IQGAP2 mRNA 明显升高，与本研究报道一致[13]。DLBCL中IQGAP2 的表达升高与微小RNA 的调控异常有关。研究表明，miR-10b-5p 结合IQGAP2 mRNA 的3’非编码区，降低IQGAP2 mRNA 的稳定性，而肿瘤发生时miR-10b-5p 显著下调，导致IQGAP2 mRNA 稳定性增加，IQGAP2 的蛋白表达上调促进肿瘤细胞的增殖及侵袭[4]。此外，IQGAP2 的表达能够调控肿瘤免疫微环境，促进肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤进展。有学者报道，DLBCL 中IQGAP2 的表达升高能够促进肿瘤微环境中免疫抑制细胞如调节性T 细胞及M2 型巨噬细胞的免疫浸润，上调免疫抑制分子如程序性死亡因子1、程序性死亡因子配体1 的表达，引起肿瘤微环境中CD8+T 淋巴细胞数目减少，CD8+T 分泌穿孔素及颗粒酶减少，肿瘤发生免疫逃逸[13]。尚有研究表明，IQGAP2 可通过促进细胞中磷脂酰肌醇3 激酶/mTOR 通路的活化，促进非GCB 型DLBCL 肿瘤细胞的过度增殖，肿瘤细胞凋亡减少，促进DLBCL 肿瘤的恶性进展[14]。这与本研究中非GCB 型DLBCL 中IQGAP2的表达较高的结果一致。本研究中，IQGAP2 阳性的DLBCL 患者CR 率明显较低，表明检测DLBCL中IQGAP2 表达有助于评估联合化疗的有效性。分析其原因，IQGAP2 表达升高能够增加DLBCL肿瘤细胞化疗治疗的耐药性，降低联合化疗治疗的CR 率。KUMAR 等[15]报道，IQGAP2 能够激活血管内皮生长因子受体2 及下游AKT 通路，诱导肿瘤细胞上皮间质转化的发生及肿瘤血管生成，促进肿瘤对化疗药物抵抗的发生。本研究中，IQGAP2 阳性表达DLBCL 患者生存预后较差，是影响DLBCL 不良预后的独立因素。笔者分析，一方面是IQGAP2 阳性表达肿瘤细胞恶性程度高，肿瘤增殖及侵袭转移能力较强，预后较差。另一方面，IQGAP2 表达升高参与促进化疗耐药性形成，降低化疗治疗效果，导致患者不良预后。因此，IQGAP2 可能是一种新的化疗疗效评估和预后判断的肿瘤标志物，有利于辅助临床医生对DLBCL 的临床治疗及预后判断。

CDC42 是Rho 家族的一种小G 蛋白，具有GTP 酶活性，是重要的信号传导分子。CDC42 能够在表皮生长因子等刺激下，促进肌动蛋白富集于细胞膜，导致细胞极化状态的形成[16-17]。近年来发现，在胰腺癌、胃癌等恶性肿瘤中CDC42 表达上调，其作为一种肿瘤促进因子，抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子p21，促进肿瘤细胞由G1 期向S期转换，导致肿瘤过度增殖[18]。本研究中，DLBCL中CDC42 表达明显上调，与DLBCL 不良临床病理特征有关，提示CDC42 的表达参与促进DLBCL的肿瘤发生及疾病进展。分析其机制，肿瘤的无限增殖导致细胞处于缺血缺氧的微环境中，引起缺氧诱导因子1A 表达升高，缺氧诱导因子1A 能够直接进入细胞核，结合CDC42 基因的启动子区域，促进CDC42 基因的mRNA 及蛋白表达，导致肿瘤的恶性增殖和转移[19]。此外，CDC42 作为GTP 酶信号通路的分子开关，能激活下游丝裂原活化的蛋白激酶、c-Jun 氨基端激酶等信号通路，促进肿瘤细胞骨架重排、细胞迁移及细胞增殖[16-18]。尚有研究报道，CDC42 的过度表达能够通过促进基质金属蛋白酶9 的表达，诱导细胞外基质降解，增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[16]。本研究中，CDC42 阳性患者联合化疗的CR 率明显较低，提示CDC42 的表达影响DLBCL 患者化疗治疗的敏感性。研究表明，化疗耐药的肿瘤细胞中CDC42 表达明显升高，CDC42 通过激活信号转导子和转录激活子3，促进多药耐药基因的表达，促进化疗药物的排出，降低化疗药物治疗的有效性，导致化疗耐药性形成[20]。此外，本研究中，CDC42 阳性表达DLBCL 患者预后较差，表明CDC42 为新的评估DLBCL 患者预后的肿瘤标志物。分析其原因，CDC42 阳性表达的DLBCL 患者对联合化疗治疗的敏感性较差，导致患者不良生存预后。临床上，医师可根据CDC42的表达，对DLBCL 临床预后进行评估，在化疗期间及时调整化疗方案及化疗药物的剂量，从而提高化疗治疗的效果，延长DLBCL 患者的生存时间。

综上所述，DLBCL 中IQGAP2，CDC42 表达升高，两者表达与Ann Arbor 临床分期、Hans 分型有关，共同参与DLBCL 的肿瘤进展。DLBCL 中IQGAP2，CDC42 阳性表达患者联合化疗的CR 率明显较低，是影响DLBCL 患者不良生存预后的独立危险因素。本研究也存在一定的不足，首先，本研究样本量有限，未能对不同病理亚型患者进行分层分析，有待今后扩大样本含量，进一步研究。此外，目前IQGAP2，CDC42 在DLBCL 中的具体作用的分子机制尚不明确，两者是否能够成为新的潜在治疗靶点，有待今后进行深入的机制研究。