临床患者血培养分离出卡明斯假谷氨酸杆菌的全基因组测序及基因功能分析

许 楠，杨旭东，田 莹，刘泽世，薛 丽，高 宁，耿 燕（．西安交通大学第二附属医院检验科，西安 70004；.西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系，西安 7006）

卡明斯假谷氨酸杆菌（Pseudoglutamicibacter cumminsii）是一种需氧、过氧化氢酶阳性的革兰阳性杆菌，其属于球杆菌属，主要分布于土壤中（Comn H J and Dimmick 1947）[1]。卡明斯假谷氨酸杆菌较少感染人类，以往从患者体内分离出的卡明斯假谷氨酸杆菌主要来自尿液和皮肤[2]，其他组织样本中尚未分离出。卡明斯假谷氨酸杆菌菌落直径通常为2～3 mm，具有湿润、光滑、灰色不透明等特点，血平板上生长无溶血环。近年来第三代基因组测序技术已被广泛应用于生物基因组的分析，但目前尚无卡明斯假谷氨酸杆菌的基因组研究报道。与传统及质谱法相比，全基因组测序不仅可鉴定微生物种类，而且可提供其代谢特点、致病基因以及耐药基因等信息，可为抗感染治疗提供更有价值的指导意见。本研究对一株从腹膜间皮瘤患者血液中分离出来的卡明斯假谷氨酸杆菌进行了全基因组测序及序列分析，以了解卡明斯假谷氨酸杆菌的代谢特点和致病性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 患者男性，36 岁，因3月前无明显诱因出现乏力，加重7 天，体重减轻、下腹痛、以及体温升高等，于2018年5月1日入西安交通大学第二附属医院接受治疗。入院前行腹部CT 及腹部彩超，提示腹腔积液、下腹及右侧腹部混合性包块。后对腹膜肿物穿刺取样进行活检，确诊腹膜间皮瘤。予以培美曲塞+卡铂方案化疗，化疗2 周期。由于患者体温升高，最高达39.5℃，血细胞检测：WBC 42.89×109/L，N% 91.90%。注射用美洛西林钠/舒巴坦钠抗感染治疗8 天后复查血细胞检测：WBC 26.97×109/L,N% 90.10%。改用注射用亚胺培南/西司他丁钠药物抗感染治疗。同时进行2 次血培养检测（2018年8月2日和8月15日）。

1.2 仪器与试剂 BD BACTEC FX 自动血培养仪及配套血培养瓶[碧迪医疗器械（上海）有限公司]；梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析仪，梅里埃MALDI-TOF MS 质谱仪（法国梅里埃公司），细菌基因组DNA 提取试剂盒（天根生物公司），美吉生物公司进行测序分析的配套试剂。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离、鉴定及药敏试验：血培养瓶放置于自动血培养仪中孵育，报警阳性后立即转种血平板，于37℃温箱中培养24h 后，取单个菌落涂片后进行革兰染色和光镜下观察。梅里埃VITEK 2 Compact 和梅里埃MALDI-TOF MS 质谱仪进行鉴定，具体操作严格按照操作说明进行。药物敏感性实验：根据欧洲抗生素敏感性测试委员会（EUCAST）2021中的棒状杆菌折点作为解释参考。

1.3.2 基因组DNA 提取：从患者血液标本中分离出的卡明斯假谷氨酸杆菌，在LB 培养液中通过30℃ 200r/min 摇菌12 h，然后8 000r/min 离心2min 收集菌体。应用天根生物公司的细菌基因组DNA 提取试剂盒提取DNA。琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，通过在280nm 波长处测定DNA 样品的A值来计算样品的浓度及纯度。随后把DNA 样品送往美吉生物公司进行测序分析。

1.3.3 基因组测序和组装：应用二代测序平台Illumina Hiseq×10 对质检合格的细菌DNA 样品进行de novo 基因组测序。主要步骤是构建～400bp的片段并进行PE150 双端测序，其中单端测序读长150bp，每个样品提供不低于基因组100×覆盖深度的原始测序数据量（raw data），通过组装得到多条基因组scaffold。应用短序列组装软件SOAPdenovo2 并根据不同的Kmer 参数拼接测序后获得的序列，选择最优的contigs 组装结果。依据reads 与contig 的对比结果进一步优化组装结果，形成scaffolds。最后，应用unicycler 软件组装出细菌的基因组，并用pilonjin 软件进行序列校正。通过位于序列两端的overlap 将序列环化，从而获得完整的卡明斯假谷氨酸杆菌染色体序列。

1.3.4 基因组组分分析：应用Glimmer 软件预测拼接完成的基因组构成。应用tRNAscan-SE v2.0 软件预测基因组中tRNA 基因的序列及其编码的tRNA结构信息。应用 Barrnap 软件预测基因组中包含的rRNA 基因序列结构及基因定位。

1.3.5 基因功能注释及次级产物基因簇分析：将卡明斯假谷氨酸杆菌菌株的蛋白序列与6 大数据库（NR，Swiss-Prot，Pfam，COG，GO 和KEGG）中的数据进行比对，对预测的基因进行功能注释。另外，由于次级代谢产物一般由多基因控制，其编码基因通常在基因组中成簇存在，我们应用antismash 软件对样本的次级代谢产物合成基因簇进行预测。

2 结果

2.1 细菌分离、鉴定及药敏结果 血培养需氧瓶在自动血培养仪中孵育20 h 后阳性报警，转种血平板，于37℃温箱中培养24h 后，取单个灰白色、不透明、表面光滑和无溶血环的圆形菌落进行革兰染色，镜下可见革兰阳性杆菌，也可观察到阴性杆菌，见图1A，B。梅里埃VITEK 2 Compact 鉴定不出结果，后经质谱鉴定为卡明斯假谷氨酸杆菌。

图1 卡明斯假谷氨酸杆菌血平板及染色

分离菌株对检测药物的MIC 分别为：亚胺培南0.004 8mg/L，利奈唑胺0.25mg/L，利福平0.008mg/L，四环素0.38mg/L，万古霉素0.25mg/L，环丙沙星0.5mg/L，克林霉素0.024mg/L，红霉素0.064mg/L，庆大霉素0.5mg/L 和青霉素0.024mg/L。

2.2 基因组分析 应用软件组装卡明斯假谷氨酸杆菌的基因组，共得到300 个Scaffolds，基因组总长度2 456 693 bp，GC 含量58.39%，N50 长度253 401bp，N90 长度35 124 bp，最长片段为46 768 bp，最短片段212 bp。Glimmer 软件预测显示卡明斯假谷氨酸杆菌的基因组中存在2 097 个编码基因，其基因总长度2 048 412 bp，占基因组全长的60.02%，基因平均长度976.83bp，见图2。基因组中17 个散在重复序列的总长1 752bp，其中SINE 转座子17，LINE 转座子6。331 个串联重复序列的总长71 570 bp，其长度分布范围45～124 bp。tRNAscan-SE v2.0 软件预测基因组含有70 个tRNA 基因，Barrnap 软件预测基因组含有8 个rRNA 基因。Antismash 软件预测到基因组中存在3 个基因，见图3。

图2 卡明斯假谷氨酸杆菌基因长度分布

图3 卡明斯假谷氨酸杆菌基因岛中的基因分布

2.3 基因功能注释

2.3.1 COG 数据库注释：COG 蛋白数据库可以预测与已知蛋白具有同源性的蛋白。将卡明斯假谷氨酸杆菌的基因序列与COG 数据库进行比对，结果显示1 768 个卡明斯假谷氨酸杆菌的基因编码蛋白功能与复制、转录、碳水化合物运转和代谢、氨基酸转运、维生素代谢、能量代谢等活动有关，见图4。

图4 卡明斯假谷氨酸杆菌蛋白质 COG 聚类分析

2.3.2 GO 数据库注释：GO 数据库可对基因编码蛋白的细胞定位、功能及其参与的生物过程进行聚类分析。通过与GO 数据库进行比对，成功注释1 431 个蛋白，见图5。其中，427 个蛋白功能未知，丰度最高的已知功能蛋白参与DNA 复制、重组以及修复。其他参与能量代谢、脂类代谢、氨基酸代谢和转录等生命活动的蛋白丰度也较高。

图5 卡明斯假谷氨酸杆菌蛋白质 GO 聚类分析

2.3.3 KEGG 数据库注释：KEGG 数据库可预测基因编码蛋白参与的生物通路。KEGG 分析显示，富集卡明斯假谷氨酸杆菌的编码蛋白的生物通路主要集中在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、维生素代谢、脂类代谢及遗传信息的传递和表达等，见图6。

图6 卡明斯假谷氨酸杆菌KEGG 代谢通路分析

2.4 碳水化合物活性酶（CAZy）数据库注释CAZy 数据库包含参与碳水化合物代谢的各种酶的信息。应用CAZy 数据库分析显示，卡明斯假谷氨酸杆菌具有27 个碳水化合物代谢相关酶，根据序列特征可具体分为碳水化合物酯酶、糖基转移酶、碳水化合物结合模块和辅助活动蛋白（主要与氧化还原相关）。

2.5 次级代谢基因簇分析 卡明节杆菌属于放线菌，而放线菌通常会合成丰富的次级代谢产物。基因序列比对显示，卡明节杆菌的1 个基因簇内包含21 个与β-内酯（β-lacton）合成有关的基因，见图7。

图7 次级代谢基因簇分析

2.6 抗生素抗性相关基因 见图8。基因序列分析显示，卡明节杆菌的基因与已知抗药基因具有同源性。序列分析发现卡明节杆菌有89个抗药相关基因，分布于基因组的1～8，10～14 等区域，其作用分别与截短侧耳素、莫匹罗星、四环素、林可酰胺、大环内酯类抗生素、唑烷类抗生素、利胆醇类抗生素、链霉杀阳菌素、利福霉素、肽类抗生素、氨基香豆素、糖肽类抗生素、氨基糖苷类抗生素、头孢菌素、头霉素、青霉烷、硝基咪唑、双环霉素、二氨基嘧啶、氟喹诺酮、单菌霉素、磺胺、甘氨酰环素和磷霉素等抗生素的抗性有关。

图8 抗生素抗性相关基因

2.7 致病性基因 见图9。卡明斯假谷氨酸杆菌的基因组中发现377 个基因与其他病原微生物具有同源性，其中208 个基因与可感染哺乳动物的病原微生物如空肠弯曲杆菌。金黄色葡萄球菌等有同源性。208 个基因中的99 个被确定为其编码产物为毒力因子。

图9 致病性基因

3 讨论

卡明斯假谷氨酸杆菌分布广泛，是土壤中最常被分离到的细菌之一。研究发现，卡明斯假谷氨酸杆菌在自然界广泛分布的原因之一是其具有在温度变化、饥饿、氧自由基、电离辐射和有毒化合物等恶劣环境中长期存活的能力[3]。近年来，许多研究聚焦于卡明斯假谷氨酸杆菌分解有机物的作用。

本研究首次报道了肿瘤患者血培养分离出卡明斯假谷氨酸杆菌。该患者确诊上皮样间皮瘤的同时发生了卡明斯假谷氨酸杆菌血流感染。出现这种情况的原因之一可能是由于肿瘤过度消耗营养导致患者免疫力下降。另外，根据患者出现胸腹腔积液和小支气管阻塞的CT 结果推断，肿瘤细胞有可能向患者其他组织侵袭浸润并造成解剖屏障会被破坏[4-5]。如果肿瘤细胞浸润到气道，有可能导致患者在呼吸过程中吸入的卡明斯假谷氨酸杆菌进入黏膜下，并在其产生的侵袭相关致病因子的帮助下侵入血流。当患者机体免疫力下降时，入侵的卡明斯假谷氨酸杆菌就引发血流感染。

随着测序技术发展和测序成本下降，全基因组测序在近年来开始被应用于病原体鉴定[6]。与传统的根据生化及免疫特征鉴定病原菌的检测技术相比，全基因组测序可以快速获得结果。与质谱法相比，全基因组测序不仅可鉴定微生物种类，而且可提供其代谢特点、致病基因及耐药基因等多方面信息，可为抗感染治疗提供更有价值的指导意见[7]。本案例对患者采取了卡铂化疗。由于铂类化疗通常会导致嗜中性粒细胞下降[8]，从而增加了患者发生感染的风险。因此，选用合适的抗生素对于指导抗卡明斯假谷氨酸杆菌感染用药以及预防院内感染具有重要意义。

本研究用全基因组测序分析了卡明节杆菌菌株基因组序列。此前尚未有卡明斯假谷氨酸杆菌菌株基因组序列的相关报道。且全基因组分析为微生物的致病性及耐药性分析提供了有价值的指导意见。测序结果显示，该患者卡明节杆菌无碳青霉素烯类抗生素的抗性基因，据此选择亚胺培南进行治疗后患者的感染迅速得到控制。本案例证明全基因组测序作为一种新的技术在指导临床用药方面具有重要价值。可以快速进行病原鉴定和分析的技术对于提高肿瘤患者的治疗效果具有更加重要的意义。相信随着全基因组测序技术的普及，它必将成为肿瘤治疗的常规辅助检测手段。另外，对于临床不明原因的发热，要重视血培养检测的应用，尤其应注意在用药前不同部位多次采集血液，结合血培养鉴定及药敏结果，及时与临床沟通，加强抗生素的合理应用。卡明斯假谷氨酸杆菌在临床实验室较少见。因此在结果判断方面，首先要排除污染问题。这就要求临床严格按照标准操作手册采样，同时送两套不同部位的血培养样本。

与其他革兰阳性菌相比，卡明斯假谷氨酸杆菌临床病例很少见。目前国内外有关该菌对人类疾病感染的研究较少，缺乏实验室诊断依据。本研究使临床微生物专业人员全面深入了解卡明斯假谷氨酸杆菌菌株，通过全基因组测序方法，获得卡明斯假谷氨酸杆菌的基因组序列。通过多种生物信息学分析方法，对该菌株的基因组功能进行分析预测，将为后续挖掘更多有特殊功能的细菌编码基因、分泌蛋白和次级代谢产物，以及构建基因工程菌株打下基础。