特殊膳食用食品中胆碱的检测研究进展

崔梦琪，张桂欣，罗 璇，王晓飞，张贞理

（淄博市检验检测计量研究总院，山东淄博 255000）

特殊膳食用食品是为满足特殊的身体或生理状况和（或）满足疾病、紊乱等状态下的特殊膳食需求，而专门加工或配方的食品，包括婴幼儿配方食品、婴幼儿辅食食品、特殊医学用途配方食品以及其他特殊膳食食用食品（辅食营养补充品、孕妇、乳母营养补充食品等）[1]。胆碱是一种添加在特殊膳食用食品中的营养强化剂，具有重要的生理功能。研究表明，胆碱在脑发育和开发认知、记忆与学习能力，以及促进肝脏机能方面都发挥着重要作用[2]。目前，胆碱的充足摄入量为婴儿125 mg·d-1，19 岁及以上的女性为425 mg·d-1，19 岁及以上的男性为550 mg·d-1[3]。人体可自身合成胆碱或者从食物中获取，对于一些特殊人群如婴幼儿、孕妇、乳母或某些疾病患者，除通过食物摄取外，还需通过特殊膳食用食品来补充。我国国家标准在婴儿配方食品、特殊医学用途配方食品、其他特殊膳食用食品中对胆碱都有明确规定[4-8]。目前，国内外已报道了许多关于胆碱的检测方法，但都有局限性，本文对胆碱检测方法进行详尽概述，以期为检测人员从事胆碱检测提供理论指导。

1 样品前处理方法

胆碱是一种强有机碱，通常情况下在动物有机体内主要以游离态胆碱、乙酰胆碱、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在，一般用水作为提取试剂只能提取样品中的游离态胆碱，因此很多研究者利用酸、碱或者酶将样品中结合态的胆碱变成游离态，然后再进行测定，因此水解法是测定特殊膳食用食品中胆碱的常见前处理方法。目前，绝大多数采用的前处理方法为样品在70 ℃下，用盐酸水解3 h，然后用磷脂酶D 酶解[9-13]。文献中报道过的其他前处理方法有酸微波消解[14-15]、碱水解[16-17]。

2 检测方法

2.1 分光光度法

紫外可见分光光度法检测样品中的胆碱大多需要先发生化学反应，生成有色物质，可见区有吸收，然后才能测定，酶法和雷氏盐分光光度法都是基于此原理。胆碱受到胆碱氧化酶的作用释放过氧化氢，在过氧化物酶的作用下，与苯酚和4-氨基安替比林反应生成有色物质，在波长505 nm 处测定吸光度并进行定量分析。《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》（GB 5413.20—2022）[9]第一法和AOAC 官方方法（999.14）[10]都是基于酶法原理进行胆碱测定。KHAN 等[11]将二氮荧光素代替苯酚和4-氨基安替比林，也可以生成有色物质，并在502 nm 处测定吸光度定量胆碱含量。RADER 等[12]优化了AOAC 官方方法，通过加入活性炭消除高含量维生素C 对酶比色法影响，并将该方法应用于一系列含胆碱的膳食补充剂，包括膳食补充片、胶囊、液体产品等。结果发现，添加到婴幼儿配方乳粉和代表性膳食补充剂中的胆碱回收率达85%～114%。雷氏盐分光光度法则是利用胆碱雷纳克铵盐的丙酮溶液在可见区有吸收的原理进行测定[18]。刘旻雯[19]和梁喜玲[20]分别对比了上述两种方法测定婴幼儿乳粉、特殊医学配方食品中的胆碱含量，结果显示两种方法测得的胆碱含量相近，均能满足检测要求。

CARTER 等[16]结合毛细管电泳法与分光光度法，实现了对婴幼儿配方食品中胆碱的检测，以1-甲基咪唑为探针，采用0.1 mmol·L-1盐酸调节背景电解质pH 值，内标法定量。丁晓静等[21]以4-甲基咪唑为探针，以10 mmol·L-1磷酸二氢钠+20 mmol·L-1磷酸+7 mmol·L-1为背景电解质，外标法测定胆碱含量，发现该方法线性关系、精密度和回收率良好，方法简单，能满足对婴幼儿奶粉中胆碱分析的要求。

酶促反应结合分光光度法是目前实验室测定胆碱最常用的方法，但该法检出限高，不适合大批量样品检测；雷氏盐分光光度法前处理复杂、耗时长；毛细管电泳采用紫外法在实际应用中存在一定制约，普通实验室使用率低，推广较困难。

2.2 色谱/质谱法

色谱法具备灵敏度高，检测结果准确度好等优势；质谱法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度的方法，有大量报道显示，色谱法和质谱法已经用于胆碱的检测。卢越圻等[22]建立了柱前衍生-高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中胆碱含量的方法，样品经水解后，Fmoc-Cl 衍生，C18柱分离后，FLD 检测，该方法标准曲线线性良好，回收率为85.0%～110.4%，RSD 为1.27%～3.78%。

LAIKHTMAN 等[23]采用离子色谱法和抑制电导率法测定婴幼儿配方奶粉中的胆碱，样品用酸水解后，注入色谱系统，分离后经抑制型电导检测器测定。同时，笔者将此方法与AOAC 官方方法（999.14）进行比较，发现测定结果（平均值）低于酶比色法，将此结果归因于省略了磷脂酶D 处理，尽管存在这种偏差，该方法仍然可以用来准确测定粉状、浓缩和即食婴儿配方奶粉中的胆碱。

ANDRIEUX 等[13]建立了液相色谱-质谱联用法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LCMS）同时测定婴幼儿配制乳粉和保健品中游离左旋肉碱和总胆碱的方法，样品经水解和酶解后，色谱分离，单四极杆检测。结果发现，该方法胆碱回收率为94%～103%，RSD 为2%左右。ZHENG 等[14]建立了采用亲水性色谱柱串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中的游离态和总的胆碱和左旋肉碱的方法。该方法胆碱回收率为85.0%～104%，RSD ＜5%。潘拾朝等[24]建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定特殊医学配方食品中胆碱含量得方法，样品经酸水解，C18柱分离，采用UPLC-MS/MS 外标法测定。该方法线性关系良好，R为0.999 3，回收率为96.1%～103.4%。

薛静[25]采用离子色谱法（Ion Chromatography，IC）、高效液相色谱-蒸发光散射检测法（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection，HPLC-ELSD）及高效液相色谱-质 谱 法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）3 种方法测定奶粉中的胆碱，并进行比较分析。检测限为HPLC-ELSD＞IC ＞HPLC-MS；精密度为IC ＞HPLC-ELSD ＞HPLC-MS；回收率为IC ＞HPLC-ELSD ＞HPLCMS，综合考虑发现IC 法更适合奶粉中胆碱的测定。此外，SAUCERMAN 等[17]利用GC 检测三甲胺间接测定胆碱，胆碱发生霍夫曼分解反应，产生挥发性三甲胺，并通过顶空进样，FID 检测。

液相色谱法部分需要衍生化，增加了前处理步骤。而离子色谱法和质谱法已成为国标方法，其中离子色谱作为实验室较为常见的仪器，可进行胆碱测定；上文介绍的液相色谱-串联质谱法仅需27 min 就可完成检测，但质谱设备较其他设备昂贵，在普通实验室中难以普及。

2.3 电化学方法

大部分电化学方法测定胆碱是利用胆碱氧化酶氧化胆碱，过氧化氢的产生和氧的消耗可以转化为电化学信号进行检测。LIMA 等[26]建立了利用流动注射和电位检测胆碱的方法，样品经过酸水解后，被固定化胆碱氧化酶氧化生成过氧化氢，过氧化氢引起碘化物的氧化，电位检测碘化物浓度变化，从而测定胆碱含量。PATI 等[27]在70 ℃条件下，用盐酸水解牛奶、奶粉和大豆卵磷脂水解物3 h，游离态胆碱通过流动注射分析和固定化胆碱氧化酶安培生物传感器检测。PANFILI 等[15]在110 ℃条件下，使用微波水解5 min，采用胆碱氧化酶电化学生物传感器的方法快速测定食品中的胆碱。PATI 等[27]描述的生物传感器测定胆碱是基于H2O2的产生，而PANFILI等[15]是基于O2的消耗。此外，PATI 等[28]还建立了双生物传感器的方法来测定游离态胆碱和结合态胆碱，使用磷脂酶D 生物传感器与胆碱氧化酶安培生物传感器，结合酸水解步骤，可定量测定牛奶和膳食补充剂中总胆碱、游离态胆碱和磷脂酰胆碱。电化学法专一性好、干扰少，但目前还未得到广泛应用，不适合批量样品检测。

3 国内外特殊膳食用食品中胆碱的检测方法对比

目前，能够检测特殊膳食用食品中胆碱的方法有很多，从样品处理、仪器、试剂等方面进行比较，结果见表1。特殊膳食用食品中胆碱的检测方法均有其特点及局限性，胆碱测定中样品制备耗时最多，通常采用的水浴时间需要3 h，利用微波消解技术可以缩短时间。目前酶促反应与分光光度法联合使用是检测胆碱最常用的方法，但酶价格较高，不适合大批量样品的检测；雷氏盐法分光光度法前处理复杂；毛细管电泳、生物传感器法研究较少，还未成熟；离子色谱法的电导检测器为通用型检测器，专一性差；液相色谱和质谱联用方法适合测定大批量样品。

表1 国内外特殊膳食用食品中胆碱的检测方法

4 展望

胆碱因其功能越来越多被应用到食品、医药领域。快速、准确的胆碱检测分析方法一直都是检测人员研究的热点，分光光度法是检测胆碱中最常用的方法，但有一定的局限性。随着仪器设备的发展，利用色谱法、质谱法、电化学法检测胆碱受到越来越多检测人员的关注，但这些方法采用传统的70 ℃酸水解3 h，耗时长，已经有作者研究利用微波炉改进水解方法，减少样品前处理时间。因此优化前处理方法，结合色谱、质谱及电化学的仪器设备，将是未来胆碱检测分析的发展方向。