高效液相色谱测定食品中固绿的前处理方法对比研究

许蕤竹

（上海华测品标检测技术有限公司，上海 201114）

人工合成色素在生产过程中可能带入有害物质，其本身过量使用也会对人体造成损害。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中对允许在食品中添加的人工合成色素的种类和限量有着明确的规定。

固绿是人工合成色素的一种，是一种酸性染料，能溶于水和酒精。固绿在中国澳门、日本、美国、加拿大等地区允许作为食品添加剂使用[1]，但在中国大陆不允许使用。国内有过进口食品中检出固绿的报告，但目前国标中并没有针对固绿的检测方法。国内外用于测定合成色素的仪器方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法等[2]，前处理方法有直接提取法、液-液萃取法、聚酰胺粉吸附法、固相萃取法等多种。本实验采用高效液相色谱法测定食品中固绿的含量，为选择出更合适的前处理方法，对比分析了不同前处理方法在检测不同基质样品时的优缺点，进而探索出更合适的检测食品中固绿的方法，以达到高效、灵敏、省时和省材的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1260 高效液相色谱仪，配自动进样器和DAD检测器，美国安捷伦；CS501 恒温水浴锅，上海博迅；G3 垂熔漏斗，上海畅辉；CP413 分析天平：感量0.001 g，奥豪斯；AL204 分析天平：感量0.000 1 g，梅特勒；Vortex 3 涡旋混匀器，美国SI；KQ-100DB 超声波清洗仪，上海圣科。

1.2 材料与试剂

固绿标准品（CAS：2353-45-9），德国Dr. E；实验室用水为GB/T 6682 规定的一级水；正己烷（C6H14），分析纯，国药公司；三正辛胺-正丁醇溶液（5%），阿拉丁；乙醇-氨水-水混合溶液，7∶2∶1（体积比），上海安谱公司；甲醇（CH3OH），色谱纯，上海安谱公司；盐酸（HCL），分析纯，国药公司；聚酰胺粉（尼龙6）：过200 µm（目）筛，国药公司；WAX固相萃取柱，150 mg/6 mL，艾杰尔公司；0.45 µm水相微孔滤膜，上海安谱公司。

1.3 标准溶液配制

（1）标准贮备溶液。准确称取按照其纯度折算为100%质量的固绿标准品0.1 g（精确至0.000 1 g），置于100 mL 容量瓶中，用pH 值为6 的水定容，配制成1.00 mg·mL-1的水溶液。

（2）标准使用溶液。临用时，移取适量标准贮备溶液，加水稀释至20 倍，用0.45 µm 微孔滤膜过滤，配制成50 µg·mL-1的水溶液。

（3）标准曲线配制。精密量取适量标准使用溶液，用水稀释，配制成浓度为5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1和50 mg·L-1系列标准溶液，供高效液相色谱仪测定。以色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4 前处理方法

（1）直接提取法[3]。称取样品10 ～20 g（精确至0.001 g），加入60 ℃的热水，用柠檬酸溶液调节pH 值至6，用水定容至50 mL，用超声波清洗仪超声提取20 min，6 000 r·min-1离心10 min，上清液过0.45 µm 水相滤膜，收集至进样小瓶中，进高效液相色谱仪测定。

（2）液-液萃取法。称取样品10 ～20 g（精确至0.001 g）至分液漏斗中，加入2 mL 盐酸、15 mL 三正辛胺-正丁醇溶液（5%），振摇分液漏斗提取，收集有机相，多次重复提取，直到有机相无色；合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗3 次，将有机相放蒸发皿中，水浴浓缩至10 mL，再转移至分液漏斗中，加入10 mL正己烷，加氨水溶液萃取3 次；合并氨水层，再用正己烷洗2 次，氨水层加入乙酸调成中性，水浴蒸发至近干，加水定容到5 mL。用0.45 µm 水相滤膜过滤，收集至进样小瓶中，进高效液相色谱仪测定。

（3）聚酰胺粉吸附法。称取样品10 ～20 g（精确至0.001 g），加入60 ℃的热水，用柠檬酸溶液调节pH 至6，取1 g 聚酰胺粉加少量水调成糊状，倒入样品溶液中，搅拌后用G3 垂熔漏斗抽滤，用pH 为4的60 ℃的水洗涤4 次；用甲醇-甲酸混合溶液洗涤4 次，然后用水洗至中性，加乙醇-氨水-水混合溶液（7 ∶2 ∶1，体积比）解吸，直到色素被完全解吸，解吸液中加乙酸中和，水浴蒸发至近干，加水定容到5 mL。用0.45 µm 水相滤膜过滤，收集至进样小瓶中，进高效液相色谱仪测定。

（4）固相萃取法[4]。称取样品10 ～20 g（精确至0.001 g），用乙醇-氨水（70 ∶30，体积比）混合溶液定容，用超声波清洗仪超声提取20 min，6 000 r·min-1离心10 min，精确移取上清液20 mL 至蒸发皿中，水浴浓缩至5 mL左右，加入20 mL水稀释；用5 mL 水反复冲洗蒸发皿，合并溶液后调节pH 至5，将溶液控制在1 mL·min-1左右的流速通过WAX 固相萃取柱，当溶液完全流出后，再用5 mL 含有0.05%甲酸的甲醇溶液淋洗WAX 固相萃取柱，最后用20 mL 含有4%氨水的甲醇洗脱，收集洗脱液，水浴蒸发至近干，加水定容到5 mL。用0.45 µm 水相滤膜过滤，收集至进样小瓶中，进高效液相色谱仪测定。

1.5 仪器条件

色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；DAD 检测器波长：635 nm[5]。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱表

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

C8色谱柱和C18色谱柱都是常用的反向色谱柱，本试验一开始为了缩短仪器分析时间，选择C8色谱柱进行分析，固绿目标峰保留时间为5.476 min。但发现在分析复杂基质时，因干扰物质较多，C8色谱柱不能提供合适的分离度，故后续试验更换了C18色谱柱，并通过多次调整流动相的梯度洗脱程序，使得固绿目标峰保留时间为10.154 min，目标峰附近的杂峰明显减少，达到了很好的分离效果。

2.2 标准曲线、线性和检出限

固绿标准曲线线性范围在5 ～50 mg·L-1，曲线方程为y=23.541 8x-3.624 7，相关系数0.999 85。选择空白基质加标试验，根据3 倍信噪比计算出方法检出限。直接提取法检出限为1 mg·kg-1，液-液萃取法检出限为2 mg·kg-1，聚酰胺粉吸附法检出限为0.5 mg·kg-1，固相萃取法检出限为0.3 mg·kg-1。

2.3 不同前处理方法对检测结果准确度和精密度的影响

分别用4 种不同的前处理方法对果汁、配制酒、糖果和蜜饯等4 种不同基质样品进行处理，做低（2 mg·kg-1）、中（5 mg·kg-1）、高（20 mg·kg-1）3 种浓度加标试验，每个添加水平重复6 次。通过加标回收率来验证检测结果的准确度，结果的相对标准偏差来验证方法的精密度，实验结果见表2 和表3。

表2 果汁和配制酒试验数据 （单位：%）

表3 糖果和蜜饯试验数据 （单位：%）

2.4 直接提取法

直接提取法操作简单、快捷，实验时间短，所需试剂耗材成本低，可快速处理大量样品。对于简单基质如果汁和配制酒，加标回收率在72.7%～105.4%，相对标准偏差在3.54%～9.69%，有较好的准确度和精密度，满足测试需求。但在处理较复杂的基质如糖果和蜜饯时，不能很好地去除干扰，数据波动较大，加标回收率在67.2%～113.5%，相对标准偏差在7.13%～16.78%，精密度不能满足测试要求，色谱图杂峰多影响定量结果。

2.5 液-液萃取法

液-液萃取法所用试剂较多，对实验人员的操作水平有一定的要求。加标回收率在58.3%～82.6%，相对标准偏差在2.15%～10.22%，相对于其他3 个方法而言，数据准确度和精密度均不具有优势，检出限也是最高的，不予推荐。

2.6 聚酰胺粉吸附法与固相萃取法

聚酰胺粉吸附法的加标回收率在75.7% ～99.6%，相对标准偏差在2.40%～8.54%。固相萃取法的加标回收率在73.9%～106.2%，相对标准偏差在3.58%～8.65%。这两个方法所得到的结果准确度和精密度基本一致，均能达到测试需求。特别在处理复杂基质如糖果和蜜饯时，数据明显优于直接提取法和液-液萃取法，检出限也能做到更低。相比较而言，聚酰胺粉法比固相萃取法操作简单，且有明显的价格优势，故在处理复杂基质时优选聚酰胺粉吸附法。

3 结论

本研究利用高效液相色谱法对食品中固绿进行检测，对比了不同前处理方法的优缺点，分析大量实验数据，并从方法难易程度、测试效率、测试成本、数据准确度和稳定性等多个维度综合考虑，得出以下结论。在处理相对干净的液体基质时优先选择直接提取法，该方法快速高效，成本低，数据可靠；在处理复杂基质时，聚酰胺粉吸附法有着明显的优势，操作简便，成本相对较低，检出限低，数据准确。