藏药二十五味松石丸抑制血管生成和上皮间充质转化改善四氯化碳-酒精诱导的大鼠肝纤维化研究

许湘，黄丹，2，陆华冠，刘延涛，刘馨，谢新，2，雷昌，2，赵洪庆，2，刘建军，2*（.湖南中医药大学 科技创新中心，长沙 40208；2.中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，长沙 40208；.中山大学附属医院第三医院超声科，广州 5060）

肝纤维化常见于慢性肝病，可由多种致病因子引起，造成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积，纤维瘢痕替代正常组织。研究发现，缺氧和炎症是诱导肝纤维化形成最重要的因素，也是导致血管生成和血管重塑的原因，故血管生成在肝纤维化向肝硬化和肝癌进展中发挥重要作用[1]。目前，抗血管生成治疗已被证明可改善肝纤维化，降低门静脉高压，延长肝癌患者的总生存期[2-3]。在肝纤维化过程中，ECM主要由肌成纤维细胞产生，而肌成纤维细胞主要来源于活化的肝星状细胞[4]。且越来越多的研究发现，上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）也是肌成纤维细胞来源之一，可能会促进肝纤维化的发生[5]。

二十五味松石丸（Ershiwuwei Songshi pill，ESP）是藏区治疗肝脏疾病的经典方剂，具有清热解毒、疏肝利胆等功效，可用于治疗肝中毒、肝痛、肝硬化、腹水等疾病，收载于2020年版《中国药典》一部[6]。研究发现，二十五味松石丸在临床上具有治疗病毒性肝炎和肝硬化等疗效[7-8]。此外，二十五味松石丸也被证明在胆汁淤积性肝损伤[9]、非酒精性脂肪性肝炎[10]和药物性肝损伤[11]动物模型中具有肝保护作用，但较少人研究该药的抗肝纤维化作用[12]。目前关于二十五味松石丸如何发挥抗肝纤维化作用的机制尚不清楚。因此，本课题通过构建四氯化碳（CCl4）-酒精诱导的大鼠肝纤维化模型，探究二十五味松石丸防治肝纤维化的可能作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量（200±20）g [湖南斯莱克景达实验动物公司，单位使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004]，实验均符合动物伦理审查，伦理批准号：LL2022062803。所有动物均饲养于湖南中医药大学实验动物中心，温度（22±2）℃，湿度50%～55%，自由饮食饮水，黑暗和光照环境各12 h，适应性喂养7 d后开始实验。

1.2 试药

大鼠谷丙转氨酶（ALT，批号：2109R28）、大鼠谷草转氨酶（AST，批号：2109R30），大鼠透明质酸（HA，批号：2211R11）、大鼠层黏蛋白（LN，批号：2211R40）（江苏酶免实业有限公司）；大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：KE20001，武汉三鹰有限公司）；苏木素染液（批号：20123002）、伊红染液（批号：19071801）、兔二步法检测试剂盒（货号：PV-9001）（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Masson试剂盒（货号：CR2108024，武汉塞维尔生物科技有限公司）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，货号：AF1032，江苏亲科生物有限公司）；转化生长因子β1（TGF-β1，货号：ab215715）、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31，货号：ab182981）（Abcam公司）；E-钙黏蛋白（E-cadherin，货号：20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin，货号：10366-1-AP）（武汉三鹰公司）；BCA蛋白定量试剂盒（货号：CW00145，康为世纪公司）。

1.3 仪器

超纯水仪（法国milli-Q公司）；HistoCore PEARL型自动脱水机、HistoCore Arcadia H型自动包埋机、RM2235型石蜡切片机、正置荧光显微镜（德国Leica公司）；Pannoramic MIDI数字玻片扫描系统（匈牙利3DHISTECH公司）；MK3型多功能酶标仪（美国Thermo公司）；Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法与结果

2.1 二十五味松石丸的制备

二十五味松石丸（松石50 g、珍珠 10 g、珊瑚 40 g、朱砂 20 g等二十五味药，批号：19061A，西藏甘露藏药股份有限公司，规格：1 g/丸）。药丸研磨后以0.4%羧甲基纤维素钠溶液为溶剂，超声波混匀制成混悬液，在使用前摇匀。

2.2 造模与给药

30只动物按照随机数字表分为正常组，模型组，二十五味松石丸低、中、高剂量组[88、176、352 mg/（kg·d）]，低剂量相当于临床等效量（按丸计算）[13]，每组6只。除正常组外，各组大鼠给予腹部皮下注射50%CCl4橄榄油溶液，每次注射剂量为3 mL·kg－1，每周2次，同时给予5%酒精饮料饲养，连续造模8周[14]。正常组给予等体积的橄榄油腹部皮下注射，以蒸馏水喂养。从造模开始给予药物灌胃治疗，正常组给予等量的0.4%羧甲基纤维素钠溶液（以双蒸水配制），一日一次，给药体积为10 mL·kg－1。末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉，收集血清和肝脏组织。

2.3 检测指标及结果

2.3.1 HE和Masson染色检测大鼠肝脏组织病理变化和胶原增生 HE染色：新鲜肝脏组织用4%多聚甲醛溶液室温固定24 h，行梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋、切片（厚度4 μm），苏木素染色5 min，然后伊红染色5 min，光学显微镜下检测大鼠肝脏组织病理变化。Masson染色方法：肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，重铬酸钾媒染剂室温浸泡15 h，其余按照试剂盒操作，光学显微镜下检测组织胶原增生情况。

结果显示（见图1及表1），正常组大鼠肝组织形态结构整齐，肝小叶完整，肝索排列紧密，未见任何的胶原纤维增生；模型组大鼠肝组织结构紊乱，无完整的肝小叶结构，假小叶形成，大小不一的脂滴弥散在肝细胞周围，大量的胶原纤维增生，纤维结构内可见炎性细胞堆积。与模型组相比，二十五味松石丸各剂量组大鼠肝组织病理损伤有明显改善，胶原纤维阳性面积明显减少（P＜0.01），高剂量组改善效果最好。

图1 二十五味松石丸对大鼠肝组织形态学的影响（箭头为坏死区域；bar＝200 μm）Fig 1 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the liver histomorphology of rats in each group（the arrow for necrosis area，bar＝200 μm）

表1 二十五味松石丸对肝纤维化大鼠模型胶原纤维增生的影响(n＝6)Tab 1 Effect of Ershiwuwei Songshi pills on collagen fiber proliferation in the rat model with hepatic fibrosis (n＝6)

2.3.2 ELISA法测定大鼠血清肝功能、TNF-α以及肝纤维化指标 取材时，大鼠腹主动脉收集全血，室温静置1 h分层后，4℃、4000 r·min－1离心15 min，分离上清液，－20℃备用。按ELISA试剂盒方法操作，检测ALT、AST、TNF-α和HA、LN水平。

如表2所示，与正常组相比，模型组大鼠血清中肝功能ALT、AST指标水平和TNF-α含量明显上升；与模型组相比，二十五味松石丸各剂量组大鼠血清能明显降低AST、ALT和TNF-α含量。如表3所示，与正常组相比，模型组大鼠血清中肝纤维化指标HA和LN明显上升；与模型组相比，二十五味松石丸各剂量组能明显降低大鼠血清中HA和LN水平。

表2 二十五味松石丸对各组大鼠血清中AST、ALT和TNF-α水平的影响( ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the serum levels of AST，ALT and TNF-α in different groups ( ±s，n＝6)

表2 二十五味松石丸对各组大鼠血清中AST、ALT和TNF-α水平的影响( ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the serum levels of AST，ALT and TNF-α in different groups ( ±s，n＝6)

注：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01.

组别AST/（U·L－1）ALT/（U·L－1）TNF-α/（pg·mL－1）正常组 80.38±7.61 29.28±4.21 65.50±10.66模型组328.21±8.75**116.57±5.12** 247.5±9.17**二十五味松石丸低剂量组200.32±9.72## 81.12±4.66## 168.8±14.17##二十五味松石丸中剂量组130.24±6.32## 63.90±2.45##120.48±8.21##二十五味松石丸高剂量组 98.34±7.42## 33.90±3.52## 75.76±13.13##

表3 二十五味松石丸对大鼠血清中肝纤维化指标HA和LN水平的影响(n＝6)Tab 3 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the HA and LN levels in the serum of rats in each group (n＝6)

2.3.3 免疫组化检测肝组织中CD31、α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达 取制得的肝组织石蜡切片，经过常规脱蜡至水；配制EDTA（pH＝9.0）抗原修复液，使用高压锅进行抗原修复；3%过氧化氢孵育30 min，PBS洗3次；5%正常山羊血清37℃封闭1 h；孵育一抗CD31（1∶2000）、α-SMA（1∶500）、TGF-β1（1∶500）、E-cadherin（1∶8000）和Vimentin（1∶2500）；后续操作按照兔二步法检测试剂盒PV-9001操作；DAB显色，苏木素染细胞核，中性树脂封片。Pannoramic MIDI数字玻片扫描仪扫描全片，随机选择区域，Image-Pro Plus6.0软件分析各组目的蛋白的平均积分光密度（IOD）。

结果显示（见图2及表4），CD31主要表达在血管内皮细胞的细胞膜上。正常组大鼠肝组织中可见少量的CD31蛋白表达，模型组可见大量的CD31蛋白表达，主要分布在增生胆管、中央静脉和肝窦周围。与模型组相比，二十五味松石丸各剂量组CD31蛋白表达均有降低（P＜0.05或P＜0.01），其中二十五味松石丸高剂量组CD31蛋白降低更明显。

图2 二十五味松石丸对大鼠肝组织血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）蛋白表达的影响（×400，bar＝100 μm）Fig 2 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the platelet endothelial cell adhesion molecule-1（CD31）protein expression in the liver tissue of rats in each group（×400，bar＝100 μm）

表4 二十五味松石丸对大鼠肝组织中CD31表达的IOD的影响( ±s，n＝6)Tab 4 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the average optical density of CD31 expression in lthe iver tissue of rats in each group( ±s，n＝6)

表4 二十五味松石丸对大鼠肝组织中CD31表达的IOD的影响( ±s，n＝6)Tab 4 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the average optical density of CD31 expression in lthe iver tissue of rats in each group( ±s，n＝6)

注：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别CD31正常组0.60±0.10模型组2.13±0.46**二十五味松石丸低剂量组1.43±0.25#二十五味松石丸中剂量组1.30±0.17##二十五味松石丸高剂量组1.00±0.21##

由图3及表5可知，α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白主要表达在细胞质上，E-cadherin蛋白主要表达在细胞膜上。正常组大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表达较少，模型组大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表达明显增多（P＜0.01）；而在正常组大鼠肝组织中E-cadherin蛋白表达量多，模型组大鼠肝组织中E-cadherin蛋白表达量明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，二十五味松石丸各剂量组大鼠肝组织能明显降低α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表达（P＜0.01）；与模型组相比，二十五味松石丸各剂量组均显著增加E-cadherin蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）。

图3 二十五味松石丸对大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较（×400，bar＝100 μm）Fig 3 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the α-SMA，TGF-β1，E-cadherin and Vimentin protein expression in the liver tissue of rats in each group（×400，bar＝100 μm）

表5 二十五味松石丸对大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin表达的IOD的影响( ±s，n＝6)Tab 5 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the the average optical density of α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin in the liver tissue of each group ( ±s，n＝6)

表5 二十五味松石丸对大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin表达的IOD的影响( ±s，n＝6)Tab 5 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the the average optical density of α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin in the liver tissue of each group ( ±s，n＝6)

注：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别α-SMATGF-β1E-cadherinVimentin正常组0.37±0.050.61±0.011.30±0.080.54±0.04模型组1.19±0.12**1.84±0.10**0.68±0.05**2.03±0.09**二十五味松石丸低剂量组0.83±0.04##1.51±0.06##0.70±0.15##1.56±0.15##二十五味松石丸中剂量组0.63±0.05##1.30±0.03##0.90±0.05#1.36±0.14##二十五味松石丸高剂量组0.32±0.12##0.51±0.12##1.34±0.11##0.56±0.13##

2.3.4 免疫印迹法检测肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达 称取100 mg各组大鼠肝组织，加入RIPA强裂解液裂解蛋白，匀浆仪磨碎组织、静置冰上继续裂解30 min，12 000 r·min－1离心20 min，收集上清液。BCA法测定组织总蛋白浓度，加入5× loading buffer，99℃变性蛋白10 min，冰上冷却，－20℃保存备用。上样量为20 μg，经电泳、转膜、封闭后，分别加入β-actin（1∶8000）、α-SMA（1∶500）、TGF-β1（1∶2000）、E-cadherin（1∶10 000）和Vimentin（1∶5000）抗体，4℃过夜。孵育二抗，室温1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，按说明书等体积配制化学发光试剂，避光显影。Image J分析各泳道蛋白灰度值，然后用目的蛋白的灰度值与β-actin的比值进行统计。

结果显示（见图4及表6），与正常组相比，模型组大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表达量明显升高（P＜0.01），E-cadherin蛋白表达量明显降低（P＜0.01）。二十五味松石丸各剂量组大鼠肝组织中的相关蛋白均有不同程度的降低或升高，与免疫组化结果相似。

图4 二十五味松石丸对大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较Fig 4 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the expression of α-SMA，TGF-β1，E-cadherin and Vimentin in the liver tissue of rats in each group

表6 二十五味松石丸对大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响( ±s，n＝3)Tab 6 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin protein expression in the liver tissue of rats in each group ( ±s，n＝3)

表6 二十五味松石丸对大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响( ±s，n＝3)Tab 6 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin protein expression in the liver tissue of rats in each group ( ±s，n＝3)

注：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别α-SMA/β-actinTGF-β1/β-actinE-cadherin/β-actinVimentin/β-actin正常组0.44±0.050.59±0.070.81±0.080.41±0.08模型组1.23±0.25**1.34±0.32**0.31±0.08**1.02±0.18**二十五味松石丸低剂量组0.67±0.02##0.58±0.15##0.64±0.09##0.70±0.07二十五味松石丸中剂量组0.59±0.13##0.53±0.10##0.74±0.06#0.63±0.06#二十五味松石丸高剂量组0.35±0.07##0.42±0.09##0.83±0.08##0.45±0.06##

2.4 统计学分析

采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计学分析，所有统计数据均以（±s）表示；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）中Tukey’s test进行多组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝损伤的共同病理阶段，其病理特征是ECM的大量沉积。早期肝纤维化是可逆的，但晚期肝纤维化导致的肝硬化是不可逆的，因此，防治肝纤维化对延缓慢性肝病进展具有重要意义[15]。全球因慢性肝病死亡人数高达200万，且随着现代生活节奏的加快呈现上升趋势[16]。藏医药是我国民族医药文化宝库的重要组成部分，理论体系完善，在治疗慢性肝病方面具有独特的疗效。二十五味松石丸作为藏区治疗肝胆疾病的代表方剂之一，能明显改善病毒性肝炎患者肝脾肿大和肝功能异常等症状[7]。肝纤维化在藏医“隆、赤巴、培根”三因理论中属于“热性”肝病的范畴[17]，二十五味松石丸方中涉及5种“药味”：绿绒蒿、诃子、檀香等11种属于“涩”味药；牛黄、鸭嘴花、伞形虎耳草等7种属于“苦”味药；西红花、石灰华、五灵脂属于“甘”味药；丁香、天竺黄、肉豆蔻属于“辛”味药；余甘子属于“酸”味药[18]。藏医经典著作《四部医典》中记载，“涩”“苦”“甘”味在临床上主要治疗“赤巴”为主的热性病。此外，二十五味松石丸配伍被认为是“西红花-牛黄”为代表的“清热药”，具有清热解毒的功效，符合藏医治疗肝病的基本原则[12]。TNF-α等炎症细胞因子水平影响慢性肝病的进展，对肝纤维化患者病情的减轻具有诊断价值[19]。本研究成功构建了肝纤维化大鼠模型并同时给予二十五味松石丸灌胃治疗，结果发现，与模型组相比，二十五味松石丸组大鼠的肝脏病理学状态明显改善，肝功能（AST和ALT）、肝纤维化指标（HA和LN）和TNF-α水平明显降低。前期研究显示，与复方鳖甲软肝片相比，该方防治效果最佳，与文献类似[12]，但其发挥作用的机制尚不清楚，因此本文重点采用3种不同剂量的药物进行研究。

有证据证明，CD31与血管生成成正相关，并在血管生物学中发挥多种作用[20]。一般肝窦内皮细胞少量表达CD31，当肝脏受损发生肝纤维化时，肝窦内皮细胞微环境改变，发生“去分化”，高表达血管内皮标志物CD31蛋白[21]。以往研究表明，内皮细胞介导的血管生成是肝纤维化一个关键特征，因此，抗血管生成治疗可能是治疗肝纤维化和门脉高压症的一种策略[22]。本研究发现，模型组肝纤维化大鼠肝组织高表达CD31蛋白，而二十五味松石丸干预组CD31蛋白有不同程度的降低，表明二十五味松石丸可能通过抑制肝窦内皮细胞血管生成来发挥抗纤维化作用。

肝纤维化发病的中心环节是肝星状细胞的激活，以α-SMA大量表达为标志，肝星状细胞的激活可诱导EMT的发生。E-cadherin是上皮细胞正常发挥功能的标志物，N-cadherin、Vimentin等是间质细胞的重要特征[23]。EMT是上皮细胞（肝细胞等）失去功能向间质细胞转化的过程，具体表现为上皮细胞的标志物E-cadherin的丢失，高表达间质细胞标志物如：N-cadherin、Vimentin等。此外，在众多细胞因子中，TGF-β1是肝纤维化中刺激肝星状细胞激活和诱导EMT发生的关键分子[24-25]。研究表明，抑制EMT的发生可在一定程度上延缓肝纤维化、甚至肝硬化的进展[26]。本研究发现，模型组大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白表达增多，而E-cadherin蛋白表达降低；而二十五味松石丸干预后TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高，表明二十味松石丸可能通过影响TGF-β分子信号从而抑制EMT发生。

综上所述，二十五味松石丸能够有效改善四氯化碳-酒精诱导的大鼠肝纤维化，其机制可能与抑制肝窦内皮细胞血管生成和EMT有关。本研究可为该方在临床治疗肝纤维化方面提供新的理论依据。