病毒样颗粒疫苗在猪病防控中的应用

杨希川

（山东省临沭县动物疫病预防控制中心，山东临沂 276700）

病毒样颗粒（VLPs）是一种空心颗粒，由病毒结构蛋白自动组合而成，结构蛋白可以是1 个或多个，在形态上与天然病毒粒子相似，被称为“假病毒”或“伪病毒”。病毒样颗粒虽然具有较强的免疫原性，但没有传染性，其主要通过与病毒感染一致的途径呈递到T、B淋巴细胞群体中，从而对免疫系统产生免疫保护反应进行诱导[1]。现阶段，国内外针对动物的病毒性疾病，至少研发了35 种病毒样颗粒疫苗进行预防。猪传染性疾病种类较多，对生猪养殖产生了严重的影响，科学防控猪传染性疾病是稳定养猪生产的重要任务。疫苗是防控动物疾病的最佳方法，但是也会产生一定的副作用，如疫苗所选用辅料溶剂的纯度、安全性及弱毒疫苗的返强风险等。因此，科研人员需要对疫苗研发多加关注，为研发更多安全的疫苗而努力。近年来，随着DNA 应用技术的不断发展和基因工程技术的进步，用于猪病防控的新型疫苗数量逐渐增多，病毒样颗粒疫苗也逐渐受到关注。本文以几种常见的猪病为切入点，对病毒样颗粒疫苗在猪病防控中的应用进展加以分析，为养猪企业在疫苗选择方面提供参考。

1 病毒样颗粒及其表达系统

病毒样颗粒是由一种或多种组织蛋白、衣壳蛋白通过自我组装而成的，具有特定空间构象的空心颗粒，直径约为20～150 nm，不含遗传物质和病毒核酸，既不能自主复制，也不具有感染力，但是该空间结构和形态与活病毒极其相似，具有纳米材料特性[2]。根据病毒样颗粒结构，可将其分为2 类，一类是无囊膜病毒样颗粒，一类是有囊膜病毒样颗粒。无囊膜病毒样颗粒不含宿主成分，主要是由病毒衣壳蛋白自我组装而成，如猪圆环病毒、乙肝病毒、人类乳头状瘤病毒的衣壳蛋白均能形成无囊膜病毒样颗粒[3]。有囊膜病毒样颗粒由表面宿主细胞膜、衣壳蛋白组成，其可同时对异源病原体及同源病原体的多种抗原进行整合，并从细胞膜中释放，如丙肝病毒、流感病毒可形成有囊膜的病毒样颗粒。病毒样颗粒有3 个突出的优势：一是病毒样颗粒以基因工程或者化学交联等方式对自身结构进行修饰（或改造）；二是病毒样颗粒能够对核酸分子（电荷数量适中）、非核酸分子及分子质量进行包裹；三是部分病毒的病毒样颗粒可分别在原核表达系统、真核表达系统中进行自我组装。上述优势的发现，为病毒样颗粒疫苗的研发提供一定支持。现有研究已经证实，病毒样颗粒在制备过程中，表达系统的选择对其产生深远影响，在不同表达系统中，衣壳蛋白特性存在较大差异，因此，对其组装和折叠产生一定影响[4]。自20 世纪80 年代开始，病毒样颗粒抗原表达中已经广泛使用了多种表达系统，在已经成功表达的病毒样颗粒中，植物类、哺乳动物类、酵母类、昆虫细胞类、细菌类等的病毒样颗粒占比分别为9%、15%、20%、28%、28%。

2 病毒样颗粒疫苗在猪病防控中的应用

2.1 对猪圆环病毒病的防控研究

在猪圆环病毒病中，2 型猪圆环病毒（PCV2）是引起6～12 周龄仔猪PMWS 的典型病原。目前，PCV2 的感染严重危害生猪健康，对产业发展造成不良影响。赵晓云等[5]根据PCV2 ORF2 基因的编码特点，发现PCV2免疫原性蛋白Cap 能够在体外自我合成病毒样颗粒，结合SUMO 表达技术，首次体外制备成Cap 蛋白病毒样颗粒，为猪圆环病毒病病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础，并且通过其他学者的验证表明，PCV2 病毒样颗粒疫苗能够对机体细胞免疫反应产生刺激作用，并且具有刺激机体体液产生免疫反应的功能[6]。徐 嫄等[7]研究发现，采用Bac-to-Bac 杆状病毒-昆虫细胞表达系统，能够获得PCV2b 重组杆状病毒，其感染HighFiveTM 细胞后，在细胞培养中检测到相关蛋白，并且自动组装成病毒样颗粒，直径在15～17 nm，此研究从侧面证实细胞培养液的上清液中存在大量病毒样颗粒，为目的蛋白纯化处理及疫苗研制提供了理论基础。王宇[8]研究发现，在无免疫佐剂的迁移下，用带有2 型猪圆环病毒抗原表位的猪细小病毒样颗粒疫苗免疫小鼠，不仅能够诱导小鼠机体产生2 型猪圆环病毒特异性的CTLA 反应，还能使小鼠体内产生猪细小病毒特异性抗体，并且这种抗体是高效价的。何至远等[9]研究证实，将2 型猪圆环病毒ORF2 蛋白插入猪细小病毒VP2 蛋白的2 个位点，形成了2 个重组体，该重组体对病毒样颗粒疫苗位点的形成并不产生影响，且具有较好的免疫原性，为病毒样颗粒多价疫苗研制找到理论根据。

2.2 对猪细小病毒病的防控研究

Cartwright 首次在流产母猪体内分离到猪细小病毒，其基因组内包含ORF，且从进化角度看，猪细小病毒NS 序列相对保守，编码的非结构蛋白在猪细小病毒DNA 复制上发挥一定作用[10]。普遍认为，引发母猪繁殖障碍的主要病原就是猪细小病毒，感染此病毒后，可引起胚胎及胎儿死亡，增加母猪流产风险[11]。对于猪细小病毒，传统疫苗以灭活疫苗为主，也包括弱毒苗，如NADL-2 弱毒株疫苗。国外学者Paul 等人收集猪细小病毒强毒株，并对其进行了50 余次的细胞连续传代，获得用于制备弱毒苗的猪细小病毒弱毒株，最终发现经口鼻为母猪接种弱毒苗后，致弱的猪细小病毒无法直接经过胎盘感染胎儿；而经子宫内接种致弱的猪细小病毒，则可对胎儿造成感染，甚至引发胎儿死亡，这也导致弱毒苗的应用被限制在非妊娠母猪中[12]。猪细小病毒基因组编码中共包含VP1、VP2、VP3 等3 种结构蛋白，其中VP2 具有中和抗体的功能，是构成病毒粒子的主要靶蛋白（衣壳蛋白），猪细小病毒VP2 结构蛋白基因免疫原性良好，可在哺乳动物杆状病毒表达系统中进行体外表达，从而形成病毒样颗粒，对中和抗体的生成起到诱导作用，具有高稳定性，可替代传统的猪细小病毒病疫苗[13]。根据上述研究结果，陆续又有多位学者将猪细小病毒VP2 基因克隆到杆状病毒表达系统中，经蛋白质表达结果显示，成功获取了猪细小病毒类病毒粒子，并诱导产生抗体[14]。还有学者将猪细小病毒VP2 基因成功在酵母表达系统中表达，同时通过体外装配方式形成病毒样颗粒，经验证，其免疫效果良好。

2.3 对猪传染性胃肠炎的防控研究

TGEV 是引发猪传染性胃肠炎的主要病原，感染后可导致病猪出现严重腹泻，同时伴有呕吐、脱水症状，具有高度的传染性，低于2 周龄的仔猪患猪传染性胃肠后，病死率高达100%，对生猪养殖造成严重经济损失[15]。研究发现，体外共表达的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）中含有sM 蛋白和M 蛋白，可形成病毒样颗粒，可对干扰素-α 产生诱导效果，对猪传染性胃肠炎具有防御作用[16]。有学者通过家蚕BAC-to-BAC 杆状病毒表达系统，成功表达了具有sM 蛋白、N 蛋白和M 蛋白的重组病毒，且病毒样颗粒体外组装试验结果显示，M 蛋白在sf9 细胞中单独表达，且M 蛋白分别于sM 蛋白、N 蛋白共表达，均可组装成病毒样颗粒，但是大小不尽相同，为研究和制备预防猪传染性胃肠炎的病毒样颗粒疫苗提供理论依据[17]。

2.4 对猪乙型脑炎的防控研究

在众多猪病中，猪乙型脑炎是一种人畜共患传染病，日本脑炎病毒（JEV）是引发猪乙型脑炎的重要病原，日本脑炎病毒E 蛋白中包含ED-Ⅲ结构，即结构域-Ⅲ，该区域负责对中和抗体进行诱导。体外试验结果显示，结构域-Ⅲ中loop3 环肽可对病毒感染进行有效抑制，小鼠攻毒试验结果发现，loop3 环肽能够发挥最强保护作用[18]。秦佳仪[19]深入研究证实，在乙肝病毒（HBV）中，乙肝核心蛋白（HBC）是该蛋白的核心结构，其不仅能够在真核细胞中被高效表达，同时可在哺乳动物细胞、细菌中进行表达，并且自动装配成病毒样颗粒。试验结果表明，在乙肝核心蛋白特定部位插入短肽序列（外源性loop3 环肽），不仅不会对乙肝核心蛋白的构象产生影响，同时也不会限制其自我组装，并且短肽能够以多次重复形式出现在病毒样颗粒的表面，使表位肽自身免疫原性得到大幅强化。因此，将loop3 环肽基因与乙肝核心蛋白基因进行重组，病毒样颗粒可视为免疫载体，进一步强化loop3 环肽表位的免疫抗原性。通过上述研究结果，国内学者将乙肝核心蛋白作为载体，重组HBC-loop3，经过纯化处理后，采用透射电镜进行观察，发现大量病毒样颗粒，为猪乙型脑炎病毒样颗粒疫苗的研制提供了思路。

2.5 对猪瘟防控的研究

猪瘟是常见的猪急性传染性疾病，传播速度快，死亡率高，尤其非洲猪瘟。我国2018 年8 月在沈阳市首次发现非洲猪瘟疫病，随后短时间内在我国多个省份点状发病，导致我国生猪存栏急剧下降，对我国生猪养殖产业造成严重影响。

引发猪瘟的主要病原为猪瘟病毒（CSFV），该病毒主要包括多肽E290 及非结构蛋白NS2-3。有研究发现猪瘟病毒中含有的CTL 细胞表位，不仅在细胞免疫中发挥重要作用，同时对体液免疫也产生影响。范京惠等[20]利用共转染昆虫细胞sf9 对杆状病毒进行重组，并在体外进行表达，并发现表达的蛋白不仅具备天然蛋白的生物学特征，同时能够自我组装并形成病毒样颗粒，在无免疫佐剂的基础上对小鼠进行免疫，成功在小鼠机体内诱导出高效价抗猪瘟病毒的特异CTL 反应，经对比试验证实，其抗体效应明显比灭活疫苗要高。Kurtovic 等[21]用乳酸菌表达了猪瘟病毒CTL 细胞表位，成功诱导出猪黏膜免疫反应，可帮助生猪抵抗致死剂量猪瘟病毒的攻击。

2.6 对其他猪病防控的研究

病毒样颗粒疫苗在其他猪病防控中的应用研究也有一定进展，如猪伪狂犬病、口蹄疫、猪蓝耳病等[22]。如国内研究者利用杆状病毒表达系统，成功表达猪蓝耳病病毒的N 蛋白、M 蛋白以及GP5、GP2b，并证实M 蛋白与GP5 共表达可组装成病毒样颗粒，且GP2b 在其中发挥帮助病毒样颗粒释放的作用[23]。

3 小结

综上所述，病毒样颗粒疫苗免疫优势明显，不仅容易被免疫系统识别，并且因其无法自主复制、不含核酸，在血清中的半衰期较长，可发挥良好的免疫效果，将有助于病毒慢性感染及肿瘤所带来的免疫耐受，使病毒样颗粒疫苗能够直接用于预防和治疗某些动物疫病。与传统疫苗相比，病毒样颗粒疫苗有效弥补了基因工程疫苗安全性方面的缺陷，是动物最具发展前景的候选疫苗之一，在猪病防控方面有良好且广阔的应用前景，未来需要加强病毒样颗粒的剂量与佐剂比例的研究，并且根据不同猪病确定最佳疫苗使用剂量及免疫途径。随着对病毒样颗粒研究的不断深入，病毒样颗粒疫苗的制备问题也将得到解决，届时将有更多的病毒样颗粒疫苗问世，为生猪疫病防控提供更多支持。