猪圆环病毒3 型快速检测方法研究进展

庄林林 陈欣雅 徐佳豪 宋春雷 申秋平

（江苏农林职业技术学院，江苏镇江 212400）

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是一种单股环状DNA 病毒，是目前已知最小的动物病毒[1]。目前，PCV 已被发现包含4 种基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中，PCV1 不表现严重的临床症状；PCV2可引起猪繁殖与呼吸道综合征、断奶仔猪综合征、皮炎及肾炎等疾病；PCV3 则可引起猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍及多系统炎症；PCV4 是由我国湖南大学生物学院兽禽病毒学研究组于2019 年发现的一种新PCV 基因型（暂定为PCV4）。

2016 年，美国Phan TG 等[2]和Palinski R 等[3]团队近乎同时报道了PCV3，患猪圆环病毒3 型病的母猪表现为心脏与多系统并发症、猪皮炎和肾病综合征，但检测PCV2 为阴性。通过全基因组分析发现，该病毒与圆环病毒科成员具有相似的基因结构和特征，但其Cap 蛋白序列和同源性相似度较低。根据基因组序列不同，可将PCV3 分为：PCV 3a、PCV 3b 和PCV 3c[3]。目前国内已有PCV3 感染犬的病例[4]，证实了PCV3 具有跨物种感染的潜在危害。当前仍无有效防控PCV3 的疫苗，本文通过对PCV3 快速检测技术进行综述，以期为快速检测及科学防控PCV3 提供参考。

1 免疫学检测方法

1.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）是将已知的抗原或抗体固定在载体表面，加入酶标抗原或抗体进行免疫学反应并催化底物显色的一种检测技术。该技术主要可分为4 种：直接法、间接法、夹心法和竞争法。目前，应用于PCV3 检测的方法主要有间接ELISA 和夹心ELISA。

1.1.1 间接ELISA

间接ELISA 是将待检测的抗体加入已标记有特定抗原的酶标板孔中，经过孵育、洗涤等步骤之后，加入酶标记的抗体，通过酶催化底物显色，根据产生的色素即可进行半定量或定量分析。为了建立间接ELISA 并快速检测PCV3 的方法，Deng 等[5]利用Ni2+-NTA 琼脂糖将重组PCV3 Cap 蛋白进行纯化，并将其作为抗原以检测血清中的抗PCV3 抗体。试验结果表明，该方法检测血清中的抗体灵敏度可达1∶3 200，且与PCV1、PCV2、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus,PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等无交叉反应。该研究通过流行病学调查表明，自2015 年以来，PCV3 已在我国广泛传播，2015—2017 年，我国猪场中PCV3 的阳性率从22.35%上升至51.88%。葛玉凤等[6]通过诱导表达及纯化PCV3-Cap 建立了一种间接ELISA 方法，通过对反应条件等进行优化，发现该方法对PCV3 抗体的检测灵敏度可达到1∶25 600，具有优异的敏感性。何博等[7]以ORF2 重组蛋白为包被抗原，建立了检测PCV3 抗体的间接ELISA 方法，其对PCV3 阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480。刘相聪[8]利用原核表达PCV3 Cap 蛋白，并将其作为包被抗原建立了一种间接ELISA 方法。结果表明，该方法具有较高的敏感性、特异性和可重复性，适于临床检测应用。

1.1.2 夹心ELISA

夹心ELISA 是一种常用的ELISA 方法，其基本原理是在特定的涂层板上，将目标抗原或抗体与高亲和力的检测抗体或检测抗原进行结合，再通过酶标记的溶液与目标分子和检测分子之间的特异性反应，形成特定的复合物，最后通过酶标记物的作用产生信号，从而检测目标分子的存在。夹心ELISA 具有选择性好、灵敏度高、适用范围广等优点，目前已广泛应用于生物医学等领域。于俊楠等[9]通过优化单抗包被、2 种抗体的浓度等，建立了一种可检测PCV3 的夹心ELISA 方法。结果表明，该方法重复性良好（变异系数≤5%），且与PCV2、猪口蹄疫病毒、猪乙型脑炎病毒、PRV 等病毒阳性血清无交叉反应。临床样本验证结果显示，检测结果与PCR方法相同率达84.6%。

1.2 免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是以胶体金颗粒为显色媒介，基于抗原抗体特异性反应原理形成免疫金复合物的一种免疫学检测技术。该技术简单快速且肉眼可观察结果，适于现场即时检测。高茵等[10]通过构建重组PCV3 Cap蛋白并优化标记pH 值、SPA 标记浓度及划线浓度等，建立了一种可快速检测PCV3 的胶体金免疫层析方法。结果表明，该试纸条具有良好的灵敏度和稳定性，且临床检测结果与ELISA 一致，表现出较好的临床适用性。

2 基于聚合酶链式反应的检测方法

2.1 常规聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）是目前常用的一种DNA 扩增及检测技术。PCR过程主要包括3 步：首先在94～95℃下将模板DNA 变性成2 条单链DNA（变性）。其次将正、反向引物分别结合到单链DNA 上（退火），最后在DNA 聚合酶的作用下，2 条引物的3’端将沿着模板链分别延伸出一条互补的DNA 链（延伸）。经过多个循环后，将形成大量的DNA 扩增产物。PCR 技术具有简单、快速、灵敏、特异性高等优点。朱小甫等[11]通过构建pGEM-T-PCV3质粒，建立了一种检测PCV3 的PCR 方法。该方法检测限为50 copies/μL，且与PCV2、PRV、PPV、PRRSV、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒等常见猪源病毒均无交叉反应。杨威等[12]建立的PCR 方法检测限可达1.13×10-3ng/μL，且具有良好的可重复性。杨晓伟等[13]为了解我国西南地区PCV3 的感染现状及其遗传特征，在基于PCV3-Cap 基因上，设计特异性引物建立了检测PCV3的PCR 方法。Shizuka 等[14]使用常规PCR 方法在日本猪群中首次发现PCV3，且与毒株全基因组序列同源性为99.5%，ORF2 蛋白同源性为98.9%～99.2%。

2.2 套式PCR

套式PCR 属于2 步PCR 方法，该方法需使用2 对引物及进行2 轮扩增。第1 轮反应中使用1 对通用引物（外引物）扩增出目标DNA 的初始片段，第2 轮反应（使用内引物）以第1 轮扩增片段为模板进行再次扩增。因此，与常规PCR 相比，套式PCR 具有更高的敏感性和特异性。同时，第2 次反应能否进行也是对第1 次反应正确性的检验，因而套式PCR 的准确性也大幅提升。杨永宁等[15]通过设计内、外特异性引物，建立了套式PCR 方法。结果显示，基于内、外引物的PCR 检测限分别为0.17 ng 和17 ng，比常规PCR 高100 倍。张静等[16]建立的套式PCR 最低检测限可达1.74×10 copies/μL，比常规PCR 高105倍，与李卓昕等[17]建立的荧光定量PCR 灵敏度相近。经临床样本验证，该方法检测结果与市售检测试剂盒具有较高的一致性。

2.3 多重PCR

多重PCR（Multiple PCR,mPCR）是一种使用2 对以上引物，实现同时扩增多个目标核酸片段的PCR 技术，有效弥补了常规PCR 只能扩增1 个目标片段的不足。多重PCR 具有效率高且成本低等优势，已被广泛应用于病原微生物检测、鉴定及遗传性疾病筛查等。目前，在国内外猪群中已发现PCV2 和PCV3 混合感染的现象，为了区分这2 种基因型，Wang 等[18]建立了可1 管式检测PCV2 和PCV3 的双重PCR。结果表明，该方法对PCV3 的检测限为2.23×106copies/μL，临床样本检测表明PCV2 和PCV3 合并感染率为14.8%。温海京等[19]通过优化退火温度、引物浓度等，建立了一种检测PCV2 和PCV3 的双重PCR 的方法来针对PCV3 的检测限为800 copies/μL。基于相似方法，朱家平等[20]建立的双重PCR 检测限低至10 copies/μL。此外，为快速准确区分检测PCV1、PCV2 和PCV3，Yang 等[21]通过设计3 对特异性引物从而建立了mPCR 方法，针对3 种病原的检测限均低至10 copies/μL。经临床样本验证，该方法检测结果与测序法和定量PCR 一致，具有良好的临床适用性。

2.4 荧光定量PCR

荧光定量PCR（Quantitative PCR,qPCR）是通过检测PCR 反应体系中的荧光强度来定量扩增产物的技术。该技术在反应体系中需加入荧光染料或探针，染料或探针可与扩增产物结合产生荧光信号。荧光信号的强度与反应体系中扩增产物数量成正相关，从而实现DNA定量分析。Xu 等[22]基于SYBR Green I 建立了可用于PCV3 检测的qPCR 方法，并对来自不同农场的部分毒株的Cap 基因进行了测序及分析，结果表明，该方法检测限为2.19×10 copies/μL，且临床样本PCV3 阳性率为31.18%。Zhao 等[23]使用TB Green Ⅱ开发了qPCR方法，检测限为78 copies/μL，可用于快速检测PCV3感染。Yuan 等[24]基于PCV3 Cap 蛋白保守区域设计了引物和探针，开发的qPCR 方法检测限为10 copies/μL，同时，该方法具有较高的特异性，并在临床样品检测方面表现出良好的应用性能。畅通等[25]利用TaqMan 探针建立的qPCR 方法敏感性同样达到10 copies/μL。Deng等[26]首次使用SPF 仔猪模型对PCV3 感染进行体内表征研究，并利用组织病理学和qPCR 进行PCV3 检测。结果表明，qPCR 方法检测限达5.5 copies/μL。Feng 等[27]基于PCV3 复制酶基因开发了基于TaqMan 的qPCR 方法，该方法的检测极限为1.5×101copies/μL。

此外，qPCR 方法同样可应用于多重检测，有利于大幅提高检测效率。Zheng 等[28]基于SYBR Green Ⅰ开发了双重qPCR 方法用于同时检测PCV3 和PRRSV。该方法对PCV3 的检测限为49.3 copies/μL，低于常规PCR，可用于检测临床样本中上述2 种病毒混合感染。Li 等[29]根据PCV2 Cap 和PCV3 Rep 基因设计特异性引物和探针，开发了可同时检测PCV2 和PCV3 的双重qPCR 方法。结果显示，该方法对PCV3 的检测限为22.5 copies/μL。同时，临床样本检测结果表明，PCV2、PCV3 在样品中的混合感染率为27.6%，适用于快速检测PCV 混合感染。

2.5 数字PCR

数字PCR（Digital PCR,dPCR） 是20 世纪末由Vogelstein 等学者研发的核酸绝对定量技术。通过使用微流控技术将反应混合物分成数千乃至上万个微小的球形微滴并分散在独立的反应室内，每个反应室内仅含有1 个或0 个目标分子。PCR 反应结束后，即可根据阳性反应室比例准确计算初始样本中的目标分子数[30]。与qPCR 相比，dPCR 无需制作标准曲线，具有更高的灵敏度和精准度。dPCR 已成为检测PCV3 感染具有前景的分子诊断技术之一。刘雨琦[31]建立了检测PCV3 的dPCR 方法，确定了最适退火温度为56.3℃、引物和探针终浓度分别为400 nM 和200 nM。分析显示，该方法灵敏度可达0.1 fg/μL，同时具有良好的可重复性。李原野等[32]基于PCV3 ORF2 基因序列设计扩增引物，建立的dPCR 方法检测限为16.35 copies/μL，同时具有良好的可重复性和特异性。此外，dPCR 同样可用于多靶标精准检测。Liu 等[33]利用微滴数字PCR 建立了可同时检测PCV2 和PCV3 的方法。该方法针对PCV3 的检测限为3 copies/μL，低于qPCR。吴朦晨等[34]通过对反应温度、引物及探针工作浓度等进行优化，建立了三重dPCR 方法。结果表明，该方法对PCV3 的检测限为11.54 copies/μL，同样优于qPCR 方法。

2.6 基于PCR 的其他方法

2022 年，孙延举[35]联合PCR 和ELISA 建立了可用于PCV3 快速检测的PCR-ELISA 方法。在该方法中，以链霉亲和素作为包被抗原，标记生物素和地高辛的PCR 产物作为一抗、HRP 标记的抗地高辛抗体作为二抗进行ELISA 反应。该PCR-ELISA 方法的检测限为5.58×102copies/μL，比常规PCR 低2 个数量级，且无需凝胶电泳，可有效减少污染风险。为了分析我国PCV3 和PCV2 的流行趋势，Zhang 等[36]建立了双重纳米PCR（nano-PCR） 方法，扩增产物分别为528 bp（PCV2）和251 bp（PCV3）2 个特异性片段。同时，该方法检测限低至9.16×101copies/μL，比常规双重PCR低2 个数量级，且与其他常见猪病毒无交叉反应性。

3 等温扩增方法

3.1 环介导等温扩增技术

2000 年，Notomi 等[37]基于具有链置换活性的DNA聚合酶研发了可在等温条件下进行DNA 高效扩增的方法——环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP） 技术。LAMP 技术利用Bst DNA聚合酶及内、外2 对扩增引物可在1 h 内扩增出109～1010个目标序列，具有简单快速、灵敏度高、仪器简单等优势，目前已广泛应用于病原微生物鉴定、疫病监测、食品安全等领域。Wang 等[38]建立了用于快速检测PCV3的LAMP 方法，检测限可达1×101copies/μL，与Zheng 等[39]的研究结果一致。Zhang 等[40]开发了可目视判断结果的LAMP 方法，以实现PCV3 的快速检测。该方法灵敏度为10 copies/μL，且与其他猪病毒无交叉反应。Park 等[41]基于PCV3 Cap 基因设计引物、以羟基萘酚蓝为反应指示剂开发了可目视检测PCV3 的LAMP 方法，检测限为50 copies/μL，且具有较好的临床适用性。为了实现PCV3 实时检测，Kim 等[42]通过加入探针建立了实时LAMP 方法以特异性检测PCV3。该方法灵敏度为50 copies/μL，优于常规LAMP 方法。此外，王妍等[43]联合LAMP 与侧向免疫层析（Lateral flow dipstick.LFD）建立了LAMP-LFD 方法并应用于PCV3 的快速检测，该方法检测限为0.2 fg/μL，比常规PCR 低3 个数量级，同时，该方法操作简单、快速，且检测结果优于PCR和常规LAMP 方法，具有良好的临床应用价值。

3.2 重组酶介导等温核酸扩增技术

重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase aided amplification,RAA）是一种等温核酸扩增技术。该技术利用重组酶、DNA 聚合酶和单链结合蛋白，可在恒温条件下从目标核酸片段扩增到大量的DNA 产物。与PCR 相比，RAA 具有操作简单、反应快速、无需热循环仪等优点。Li 等[44]基于PCV3 Cap 基因设计特异性引物和探针，开发了一种可用于PCV3 快速检测的RAA 方法。利用该方法，在39℃下，30 min 内即可完成检测。该方法灵敏度为38 copies/μL，在现场即时检测方面具有应用潜力。为了缩短检测时间并实现实时监测，吴江等[45]建立了实时荧光RAA 方法。该方法可在39℃下20 min 内完成检测，且检测限达102copies/μL，适于分子检测条件有限的机构使用。

3.3 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）是一种新型核酸等温扩增技术，可以在常温（37～42℃）条件下进行快速、高效地扩增出特定核酸序列[46]。该技术可利用聚合酶、重组酶和单链DNA 结合蛋白等共同作用引导目标核酸不断解链、扩增和释放。Wang 等[47]针对PCV3 Cap 基因设计RPA 引物和探针，开发了用于快速检测PCV3 的实时荧光RPA 方法。结果表明，该方法具有高特异性，灵敏度为23 copies/μL，可在20 min 内完成检测。吴佳骏等[48]建立了靶向PCV3 Cap 蛋白的实时RPA 方法，灵敏度可达4.56×102copies/μL，与常规PCR 方法灵敏度相当。同时，该方法与PCV1、PCV2、PRRSV、PRV、猪塞内卡病毒等无交叉反应。临床验证表明，该方法检测结果与使用PCR 检测结果一致。

3.4 酶促重组等温扩增技术

酶促重组等温扩增技术（Enzymatic recombinase amplification,ERA）是近年来发展起来的新型核酸扩增技术，其原理是采用介导DNA 重组的酶来高效扩增目标DNA 序列。ERA 技术具有低温适应性、简单快速以及高灵敏度等优点。Zhang 等[49]将ERA 与CRISPR/Cas12a 技术相结合，应用于PCV3 快速检测。ERA-CRISPR/Cas12a 反应可以在单分子水平上检测PCV3 DNA。同时，该方法具有高特异性，与PCV1、PCV2、PCV4 及其他猪病毒均没有交叉反应，并可在1 h 内完成检测。该技术具有良好的诊断应用前景，有望成为检测病毒感染的重要工具手段。

3.5 聚合酶螺旋反应

聚合酶螺旋反应（Polymerase spiral reaction,PSR）是一种近年来发展的核酸等温扩增技术。通过在2 条引物的5’端加上1 段互为反向的序列，可以使引物以自身为模板，按照自螺旋扩增的方式进行目标片段扩增。该技术基于PCR 引物的设计思路和Bst DNA 聚合酶的链置换活性，实现1 对引物和1 种酶在等温条件下对核酸进行高效扩增[50]。PSR 反应体系简单，具有良好的特异性和敏感性。Ji 等[51]建立了可高效检测PCV3 的PSR方法。使用62℃水浴，50 min 可完成PCV3 目标基因扩增，其检测限为1.13×102copies/μL。试验表明，PSR方法具有较高的特异性，且检出率高于LAMP 方法，适于资源条件有限的实验室使用。

4 原位杂交技术

原位杂交技术（In situ hybridization,ISH）是将核酸探针与检测样品中靶核酸特异性杂交的方法[53]。该技术的原理是使用DNA 或RNA 分子探针与已知目标DNA或RNA 序列进行杂交，从而确定这些分子在细胞或组织样本中的位置和数量。在ISH 技术中，探针一般被标记荧光或放射性等，可以被视觉或检测设备测量和检测。ISH 技术可以对特定序列进行检测及定位，具有直接、快速、特异等优点。Phan 等[2]使用ISH 方法，将载玻片与目标探针在40℃的杂交缓冲液中反应2 h。研究表明，PCV3 在心肌细胞和心肌中的炎症细胞等多处存在，而在肺组织切片中未能检测到PCV3。Mora-Díaz等[52]通过ISH 方法在猪生殖期病例组织中分离出PCV3。同时，研究表明，PCV3 感染会引起猪的心肌炎和系统性血管炎等多系统炎症。Taehwan 等[54]通过使用PCV3特异性DNA 探针进行原位杂交来确认PCV3 感染，首次在流产胎儿中检测到PCV3。

5 宏基因组测序分析

宏基因组测序分析技术是一种用于研究微生物群落的高通量测序技术，可以快速获取微生物群落的全基因组序列信息，并进行群落结构、功能和代谢通路等多个方面的分析[55]。目前，宏基因组测序已经从分析单个基因发展到可提供整个生态系统相关的复杂遗传信息。这对发现新物种、分析生态系统构成、研究宏基因组的功能和代谢途径等具有重要意义。PCV3 的发现也得益于该技术，Palinski 等[3]通过PCR 和宏基因组测序检测到母猪流产的胎儿含有高水平的PCV3，并通过滚环扩增证实引起猪皮炎肾病综合征临床症状的病原为PCV3。Franzo等[56]通过宏基因组测序分析，检测出患有仔猪断奶发育不全综合征的病例中存在PCV3。宏基因组测序分析为病原体的发现、溯源及组成等提供了高效快捷的方法。

6 小结与展望

猪圆环病毒3 型（PCV3）在全球范围内传播广泛，已引起养猪业的广泛重视。为了有效监测和控制其传播，研究人员已经开发出多种快速检测方法，包括免疫学方法、多种基于PCR 的方法、等温扩增、原位杂交、宏基因组测序技术等，为快速精准检测PCV3 提供了有力技术支持。免疫学方法尽管简单、快速且可监测抗体，但目前在灵敏度和特异性方面仍有待加强。基于PCR 的方法虽然在PCV3 检测中具有高灵敏度和特异性，但其操作过程需要具有专业能力的技术人员，且检测结果观察需依赖操作繁琐的凝胶电泳，或使用成本较高的荧光探测设备。等温扩增技术作为PCR 的可选替代方案，具有设备简单、反应快速、支持目视判断结果等优势，但目前相关技术在引物设计、反应体系成熟度及可重复性等方面仍有待提升。原位杂交、宏基因组测序为PCV3检测提供了重要技术支持，但现有方法仍难以满足PCV3 现场快速检测需求。

未来，随着PCV3 研究的不断深入，研究人员将继续优化现有快速检测方法，提高检测敏感性、特异性和可重复性。同时，随着检测技术水平的不断提高，更精准、快速和便捷的PCV3 检测技术将被研发。此外，在多学科交叉融合的发展趋势下，高通量、便携式、智能化的一体化检测设备将不断被研发，为实现PCV3 快速精准检测提供新的方法与技术支撑。