维生素与唇腭裂发生相关性的研究进展

夏溦瑶 贾仲林

1.口腔疾病防治全国重点实验室 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041；

2.口腔疾病防治全国重点实验室 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院唇腭裂外科 成都 610041

唇腭裂是口腔颌面部最常见的先天性畸形之一，发病率为1‰~2‰[1]，分为非综合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）和综合征型唇腭裂。NSCL/P的发病机制与遗传因素和环境因素均有关。维生素作为环境因素之一，与NSCL/P的发生密切相关[2-7]，胎儿面部发育时间为妊娠期3~8周，腭部发育则主要集中于8~12周。在孕前3个月至孕前期3个月，各族维生素的合理补充尤为重要。

维生素A（vitamin A，VitA）影响腭胚突间充质（embryonic palatal mesenchymal，EPM）细胞的增殖分化，参与腭形成的调控[8-9]。维生素B族中，维生素B1（vitamin B1，VitB1）、维生素B6（vitamin B6， VitB6）、 维生素B9（vitamin B9，VitB9）可在暴露于致畸物时发挥保护作用；VitB9影响颅面骨与软骨的发育，影响口面裂（oral-facial cleft，OFC）的发生。维生素C（vitamin C，VitC）可预防亚硝酸盐等的唇腭裂致畸作用[10]；同时VitC作为抗氧化剂，可清除自由基，影响甲基化水平[11]。此外，新生儿唇腭裂发病率与季节存在一定的相关性，考虑到光照等因素，维生素D（vitamin D，VitD）水平与唇腭裂的发生也可能存在联系[12]。本文就各族维生素与唇腭裂发生的关系及机制研究进展进行综述，为孕期合理补充维生素，预防和减少唇腭裂的发生提供依据。

1 维生素A族与唇腭裂

维生素A族是一类脂溶性维生素，在胚胎发育中发挥重要的作用。Alade等[3]的一项Meta分析显示：妊娠期补充VitA可以显著降低NSCL/P的发生风险（P=0.03），但是并没有显著降低非综合征型腭裂（nonsyndromic cleft palate only，NSCPO）的发生风险（P=0.1）。而Johansen等[13]对挪威人群的研究表明：补充VitA对NSCPO有预防作用。此外，VitA对唇腭裂的发生存在“双刃剑”的作用。研究[8,14]表明：VitA过量或不足均会导致动物和人类的先天畸形如唇腭裂，而适量补充VitA可以预防唇腭裂。维生素A族及代谢产物中与唇腭裂相关者包括13-顺式视黄酸（13-cis-retinoic acids，13-cis-RA） 和全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，ATRA）等，而ATRA的唇腭裂致畸能力比13-cis-RA强4~8倍[15]。

转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β相关信号通路与维生素A族的唇腭裂致畸作用密切相关[16]。在软骨发育过程中，TGF-β/Samd 信号促进软骨细胞的增殖和终末分化。Zhang等[9]研究表明：ATRA可以抑制MEPM细胞生长，并呈时间和剂量依赖性。同时过量视黄酸会造成腭突生长迟缓从而形成腭裂，在此过程中ATRA可能上调Smad7表达，并降低Smad2磷酸化水平来抑制EPM细胞生长。ATRA还可以调控TGF-β3启动子的去甲基化，在E14抑制EPM细胞的增殖[16]。此外，TGF-β信号也参与到叶酸降低ATRA诱导腭裂发生的过程中[17]。

Wnt信号通路也与唇腭裂有关[18]，Wnt信号下调是视黄酸诱导腭裂的原因。Hu等[19]通过检测腭突组织的Wnt信号通路蛋白，发现视黄酸处理组在E13.5和E14.5时Gsk-3表达下降，同时Wnt信号通路下游分子如β-连环蛋白、Lef-1和c-Jun等表达均受到抑制。Krutzen等[20]研究表明：ATRA显著抑制Wnt标志基因AXⅠN2的表达从而下调Wnt信号，阻止EPM细胞向成骨细胞分化，导致唇腭裂的发生，尤其是黏膜下腭裂。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）可以诱导成骨或成脂的发生，进而影响腭的形成。Chen等[21]发现：EPM细胞在成骨培养基中，成骨分化早期Smad5 mRNAs表达增强；而在加入ATRA后，Smad mRNA表达水平下降。同时ATRA还通过上调BMPR-ⅠA表达，并下调BMPR-ⅠB表达来调节BMP-Smad通路，从而诱导EPM细胞的成脂分化，抑制其成骨分化。Guo等[22]也证实：ATRA处理的MC-3T3-E1细胞中，BMP7 mRNA和蛋白水平下降，抑制EPM细胞的增殖。

ATRA 还可以与上皮生长因子（epithelium growth factor，EGF）作用于腭突中缝上皮（medialedge epithelium，MEE）细胞，从而影响腭的发育。ATRA可以抑制周皮和基底MEE细胞的凋亡[23]。研究[24]证实：ATRA处理组胎鼠的MEE细胞可持续表达EGF，从而抑制MEE细胞的凋亡并促进其增殖。

总之，维生素A族与TGF-β、Wnt等多个信号通路发生相互作用[25]，影响EPM细胞的增殖分化和腭突的生长。而由于维生素A族对唇腭裂发生的“双刃剑”作用，所以孕期补充VitA需注重剂量。《中国居民膳食营养素参考摄入量》推荐孕妇每天VitA摄入量为700 μg视黄醇活性当量（retinol activity equivalent，RAE）。

2 维生素B族与唇腭裂

复合维生素B的应用能够降低唇腭裂的发生率。不同维生素B与唇腭裂发生的致畸或保护作用不同，其中与唇腭裂相关的B族维生素包括VitB1、VitB6、VitB9和维生素B12（vitamin B12，VitB12）等。

2.1 VitB1与唇腭裂

VitB1又称硫胺素，是一种水溶性维生素，在细胞代谢和能量生成中发挥重要的作用。研究[4]表明：胎鼠唇腭裂的发生与孕鼠羊水中低浓度VitB1存在相关性。Scheller等[26]研究发现：A/WySn-CL/P小鼠胎盘上存在硫胺素转运体2（thiamin transporter-2，ThTr2）剪接突变体，通过胎盘屏障的转运功能的丧失，使得羊水中的VitB1浓度降低，从而导致唇腭裂的发生。这说明孕期大量补充VitB1可能也无法预防胎鼠基因突变所致VitB1摄取异常导致的唇腭裂的发生。同时VitB1具有很强的抗致畸作用，补充VitB1能够降低暴露于环磷酰胺和地塞米松后腭裂的发生率，特别是暴露于环磷酰胺的雄鼠腭裂率可明显降低（由62.4% 降至40.4%，P<0.001）[27]。值得注意的是，暴露于致畸剂前补充VitB1才能够起到有效的保护作用，而暴露后补充则效果不明显。

2.2 VitB6与唇腭裂

VitB6属吡啶衍生物，生物活性形式为磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP），在多种细胞生理活动中发挥重要辅助作用[28]。一项在菲律宾人群中的调查[29]研究表明：孕妇缺乏VitB6使唇腭裂发生风险增加。但是另一项在犹他州的调查研究[30]表明：PLP水平与唇腭裂发生之间没有很强的关联，这可能是由于遗传和地域等其他因素造成的。VitB6拮抗剂具有唇腭裂致畸作用。咖啡因作为VitB6拮抗剂，可以干扰VitB6依赖性转硫途径，导致血浆同型半胱氨酸水平升高[31]。VitB6还可能干扰糖皮质激素与腭间充质细胞上的受体结合，从而减少可的松诱导的腭裂的发生率[32]。VitB6补充剂可以降低环磷酰胺和过量VitA诱导的唇腭裂发生率。目前VitB6缺乏增加唇腭裂患病风险的机制尚未完全明确。在叶酸代谢过程中，PLP是四氢叶酸和丝氨酸转化为5,10-亚甲基四氢叶酸的重要辅助因子，因此VitB6缺乏可能通过叶酸代谢异常从而造成唇腭裂的发生。

2.3 VitB9与唇腭裂

VitB9又称叶酸（folic acid，FA），对NSCL/P的保护作用在以往研究[5,33-34]中已得到证实，但需注重补充剂量。当孕期叶酸补充过量时，血液中未代谢叶酸（unmetabolized folic acid，UMFA）水平增加，可能会增加后代患自闭症、代谢异常等的风险[35-36]。《中国居民膳食营养素参考摄入量》推荐孕妇每天摄入叶酸量为600 μg膳食叶酸当量（dietary folate equivalent，DFE）。研究[37]表明：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因和甲硫氨酸合成还原酶（methionine synthase reductase，MTRR）基因突变与NSCL/P有关。叶酸主要以四氢叶酸形式参与体内多种代谢，当叶酸及其代谢产物缺乏时，会造成核酸甲基化甚至碱基对的损伤。叶酸还会影响神经管和神经嵴等高增殖率细胞，进而影响颅颌面骨和软骨的发育[38]。

2.4 VitB12与唇腭裂

VitB12是妊娠早期必需的营养物质，与叶酸一样都是单碳代谢中的重要辅助因子。研究[6]表明：唇腭裂患儿的母亲存在低水平VitB12及低水平甲基丙二酸（methylmalonic acid，MMA）的可能性是对照组的6.5倍；与VitB12代谢有关基因的多态性也与唇腭裂存在相关性[33,39]。在腭的形成过程中，VitB12也能够抵抗部分致畸剂的作用。VitB12缺乏的唇腭裂致畸机制尚未明确。当VitB12缺乏时会影响DNA复制，导致基因组异常[40]。同时VitB12缺乏时，MMA水平升高，影响线粒体功能，从而导致炎症因子水平升高，产生过量活性氧[41]，这一过程也可能参与唇腭裂形成。

3 VitC与唇腭裂

VitC是一种人体不可或缺但又无法自行合成的维生素，可与人体代谢产生的氧自由基结合发生还原反应，清除有害的氧自由基从而起到保护细胞的作用；同时VitC也是单/双加氧酶的重要辅助因子，可促进药物的生物转化。研究[7]发现：OFC病例组孕妇VitC摄入量和正常对照组存在明显差异（P=0.04）。目前VitC缺乏影响唇腭裂发生的具体机制并不明确，笔者根据VitC和唇腭裂的相关研究进行总结和分析，可能的相关机制如下。

VitC可以减轻亚硝酸盐对唇腭裂的影响。酰胺类、仲胺及叔胺类药物在酸性环境中可以与亚硝酸盐反应形成致畸物质——N-亚硝基化合物。在人群中可观察到，孕期前3个月接触可硝化药物与心脏畸形、肢体畸形和唇腭裂等先天性畸形有关[42]。而VitC可以抑制内源性N-亚硝基化合物的形成[43]。研究[10]表明：孕期前3个月暴露于酰胺类药物，未补充VitC组（OR=1.78）发生唇腭裂的风险高于补充VitC组（OR=1.04）；暴露于仲胺类药物的孕妇，每日膳食补充VitC超过85 mg组（OR=0.96）发生唇裂的风险高于每日膳食补充低于85 mg组（OR=1.39）。

VitC还可以逆转孕妇吸烟对胎儿DNA甲基化水平的影响。研究[44-46]表明：孕妇吸烟与NSCL/P的发生密切相关。妊娠期孕妇吸烟会导致新生儿CpGs的DNA甲基化，其中包括与唇腭裂密切相关的致病基因[47-48]，如GRHL3、VAX1、TP63、BPM4基因等[49-51]。研究者[50]在母亲孕期吸烟的新生儿BMP4基因中发现了6个有全基因组显著性差异的CpGs，并且发现妊娠期吸烟造成新生儿CpGs的DNA甲基化可以具有持久性作用。还有研究[11]发现：VitC可以降低甚至逆转甲基化水平，妊娠期补充VitC可以降低或逆转吸烟相关的基因组和不同组织的高/低甲基化位点的变化。目前尚缺乏VitC降低妊娠期吸烟造成的唇腭裂相关基因DNA甲基化的相关研究和直接证据，同时妊娠期吸烟和VitC影响部分基因的甲基化水平的机制尚未完全明确。

VitC可能减轻孕妇吸烟对胎盘血流的影响，缓解胎儿缺氧。胎盘血管上存在尼古丁乙酰胆碱受体，因此尼古丁能参与胆碱能调节从而影响胎盘血流[52]。当胎盘血流量受到影响时，胎儿血供会随之减少，造成胎儿缺氧。此外，烟草中的CO会减少胚胎的氧气利用率，造成胎儿缺氧[53]。而缺氧会激活小类泛素化修饰途径（small ubiquitinlike modifier，SUMO），可逆地修饰唇腭裂相关基因的表达产物，如MSX1编码的转录因子等，影响胎儿颌面部发育[46]。Lo等[54]研究表明：VitC可以减轻吸烟对胎盘血流动力学的不利影响，缓解尼古丁暴露导致的胎盘血管血流减少以及缺氧造成的胎盘组织学改变，但是机制尚未明确。该研究还发现：相比于单纯尼古丁暴露组，暴露后补充VitC组羊水中的尼古丁含量反而升高，据此研究者认为VitC可能不会提高母体尼古丁的代谢和清除，却可能增加胎儿尼古丁的代谢和排泄，但还需要进一步研究验证。虽然孕期VitC在一定程度上可以缓解尼古丁暴露带来的对胎盘及胎儿的不利影响，但是戒烟仍是预防妊娠异常和胎儿先天性畸形的最佳选择。

综上，VitC可以减轻唇腭裂致畸物的影响，并影响胎儿甲基化水平。同时VitC还可改善吸烟孕妇胎盘血运情况，减轻吸烟对胎儿血供的影响。因此，孕期应注重VitC的补充，有利于降低胎儿OFC的发生风险，目前推荐孕妇每天的VitC摄入量为100 mg。

4 VitD与唇腭裂

VitD是一种来源于胆固醇的复杂有机分子。目前国内外对VitD与唇腭裂的相关性研究相对较少。已有研究[55-56]发现：新生儿唇腭裂的发生率与季节有关，出生于冬季的新生儿唇腭裂发病率与夏季存在明显差异。在此基础上，Chung等[12]提出唇腭裂发生的季节性变化可能与阳光照射量、VitD合成有关。卜秀芬等[57]研究发现：孕妇25-羟基维生素D水平与NSCL/P存在显著相关性。邰怡等[58]发现：维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）发生遗传变异与NSCL/P存在相关性，携带CA单体型的VDR基因是NSCL/P发病的遗传因素，且NSCL/P组患儿的25-羟基维生素D低于对照组。

VitD影响唇腭裂发生的机制可能与钙有关。Hong等[59]研究表明：补充钙可以降低唇腭裂的发生风险（OR=0.27）。VitD可以调节钙的吸收与代谢，在促进钙吸收、维持钙平衡和骨矿化中起到重要作用[60]，因此VitD可能参与钙等元素的吸收代谢进而影响唇腭裂的发生。

5 VitE与唇腭裂

VitE是一种脂溶性维生素，具有抗氧化功能。天然VitE可分为生育酚和生育三烯酚，其中ɑ-生育酚活性最强。研究[7]表明：唇腭裂组和对照组孕期补充VitE的量存在显著差异（P=0.04）。孕期推荐的VitE每天摄入量为700 mg α-生育酚当量（α-tocopherol equivalent，α-TE）。但目前关于VitE与唇腭裂发生关系的临床研究较少，具体机制也尚不明确，还需更多相关研究来探索。

综上所述，各族维生素与唇腭裂的发生存在相关性，孕期注重各族维生素的补充对预防唇腭裂的发生具有非常重要的意义，尤其是对于高发病率、有家族史和致畸物暴露的人群，补充充足的维生素可以降低致病因素的积累，避免达到发病阈值。未来通过对唇腭裂分子遗传背景进行深入了解，可以综合分析遗传因素与维生素等环境因素对疾病发生的影响。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。