基于HPLC指纹图谱与多成分含量测定的凹叶景天正丁醇部位差异性研究*

叶梅芳,魏怡林,刘媛媛,江露娟,蒙雪雁,丘琴,2,甄汉深,黄凤音,甄丹丹

(1.广西中医药大学,南宁 530200;2.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心,南宁 530200)

凹叶景天(SedumemarginatumMigo.)为景天科景天属多年生肉质草本植物,别名马牙半支、石板菜、打不死等。其始载于《本草纲目拾遗》[1],在《全国中草药汇编》《湖南药物志》《中国民族药志要》《中华本草》《中药大辞典》《四川中药志》等也有记载。全草均可药用,味苦、酸,性凉,归心、肝经,具有清热解毒、止血和平肝的作用,可用于治蛇咬伤、黄疸、跌打损伤等病症。现代研究表明凹叶景天具有抗肿瘤[2-3]、抗氧化[4]、镇静催眠[5]、止血止痛[6]等药理作用。目前,对凹叶景天的性状鉴别、薄层鉴别[7-8]、紫外光谱鉴别[9-10]、化学成分预实验[11]以及槲皮素、山奈素、异鼠李素、甘草苷等成分的含量测定[12-15]已有报道,但其质量标准尚未完善。中药指纹图谱作为中药应用较为广泛的质量评价模式之一,因其能够体现中药成分的整体性,所以在评价中药材的质量时应用广泛[16-17]。本课题组对凹叶景天乙酸乙酯部位进行了指纹图谱与多成分含量测定研究[18],关于凹叶景天正丁醇部位的指纹图谱和含量测定研究笔者尚未见报道。刘昌孝等[19]首次提出中药质量标志物(Q-Marker)概念,Q-marker是与中药的功能属性密切相关,有明确的化学结构,是可以进行定性鉴别和定量测定的物质。没食子酸具有抗肿瘤[20]、抗炎[21]、抗氧化[22]作用;原儿茶酸具有抗氧化[23]、抗菌[24]、保护急性肺损伤[25]、保护心肌缺血-再灌注损伤[26]等药理作用;异槲皮苷具有抗氧化作用[27]。以上3种成分均与凹叶景天的功效和药理作用相关,将其作为含量测定指标成分科学且合理,与中药Q-marker的原则相符。为了科学评价凹叶景天,笔者在本研究采用指纹图谱结合化学计量学,建立凹叶景天正丁醇部位的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,并进行相似度评价、聚类分析、主成分分析研究,对凹叶景天正丁醇部位中的没食子酸、原儿茶酸和异槲皮苷3个成分进行含量测定。报道如下。

1 材料与仪器

1.1材料 对照品:没食子酸(中国食品药品检定研究院,批号:110831-201204,含量≥99%);原儿茶酸(中国食品药品检定研究院,批号:110809-200604,含量≥99%);异槲皮苷(成都曼斯特生物科技有限公司,批号:MUST-18051005,含量≥98%)。正丁醇(天津市大茂化学试剂厂,批号:20180401,AR);95%乙醇 (成都市科龙化工试剂厂,批号:20170901,AR);甲醇(成都市科隆化学科技有限公司,批号:2018082702,AR);色谱乙腈 (美国TEDIA公司,批号:18035148);色谱甲醇 (美国TEDIA公司,批号:17095090);磷酸为分析纯;超纯水。10个不同产地凹叶景天主要来源于广西壮族自治区、浙江省和湖北省,经广西一心医药有限责任公司马利飞副主任中药师鉴定为景天科景天属植物凹叶景天(SedumemarginatumMigo.)的地上部分。药材来源见表1。

表1 10个产地凹叶景天药材来源

1.2仪器 KQ500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HWS-26电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司);DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司);Waters e2695高效液相色谱仪,W2998PDA检测器(美国Waters公司);Waters e2695型高效液相色谱仪,2489UV检测器(美国Waters公司);Simplicity超纯水系统(密理博中国有限公司);TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);SQP电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,感量:0.1 mg]。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱:Thermo ODS-2 HYPERSIL色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(D)-0.12%磷酸溶液(B);梯度洗脱(0～10 min,3%→4%D;10～22 min,4%→6%D;22～55 min,6%→12%D;55～95 min,12%→13.5%D;95～125 min,13.5%→22%D;125～130 min,22%→3%D);流速:0.8 mL·min-1;检测波长:260 nm;柱温:30 ℃;进样量:5 μL。

2.2样品的制备 取凹叶景天药材粗粉150 g,用10倍量的70%乙醇浸泡30 min,回流提取3次,分别回流提取2,1.5,1 h,纱布过滤,合并提取液,于旋转蒸发仪减压浓缩,得到70%乙醇提取物浓缩液,再用正丁醇分别萃取6或7次,减压浓缩后置于水浴锅(<60 ℃)挥成浸膏,减压干燥,制得正丁醇部位干浸膏样品,置于干燥器中保存备用。

2.3溶液的制备

2.3.1对照品溶液的制备 称取没食子酸、原儿茶酸和异槲皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并定容,分别制成单一的对照品储备液;精密吸取上述3个对照品储备液制成浓度分别为没食子酸0.092 0 mg·mL-1、原儿茶酸0.018 5 mg·mL-1、异槲皮苷0.275 8 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备 取凹叶景天药材正丁醇部位样品0.1 g,精密称定,置于2 mL离心管中,加甲醇超声溶解,分别转移到2 mL量瓶中并定容,转移至2 mL离心管,于13 000 r·min-1下离心10 min(r=4 cm),经微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过,即得。

2.4指纹图谱的建立

2.4.1精密度实验 取S1产地凹叶景天正丁醇部位样品0.1 g,精密称定,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样于高效液相色谱仪,连续进样测定6次,以12号峰异槲皮苷为参照峰(S),计算得到各色谱峰的相对保留时间RSD值为0.02%～0.35%,相对峰面积的RSD值为0.30%～1.81%,表明仪器的精密度良好。

2.4.2重复性实验 称取S1产地凹叶景天正丁醇部位样品共6份,每份0.1 g,精密称定,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样,以12号峰异槲皮苷为参照峰,计算得到各色谱峰的相对保留时间RSD值为0.01%～0.61%,相对峰面积的RSD值为0.10%～3.04%,表明该方法的重复性良好。

2.4.3稳定性实验 取S1产地凹叶景天正丁醇部位样品0.1 g,精密称定,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件分别于0,2,4,9,20,22,24 h进样7次,以12号峰异槲皮苷为参照峰(S),计算得到各色谱峰的相对保留时间RSD值为0.02%～0.28%,相对峰面积的RSD值为0.69%～2.90%,表明供试品溶液的稳定性良好,实验结果可靠。

2.4.4凹叶景天正丁醇部位指纹图谱的建立及相似度评价 将S1～S10产地凹叶景天正丁醇部位样品,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样,得到10个不同产地样品的HPLC指纹图谱数据。将所得图谱数据自动积分后导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版软件” ,设S1为参照图谱,经过多点校正,自动匹配,采取Mark峰匹配色谱峰,以中位数法生成叠加图和共有模式图,共标定18个峰,通过与对照品对比,指认其中3个成分,分别是1号峰没食子酸、2号峰原儿茶酸、12号峰异槲皮苷,结果见图1、图2。12号峰(异槲皮苷)分离度较好,保留时间适宜,可确定其为参照峰(S)。计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积,结果见表2、表3。各共有峰相对保留时间的RSD值为0.10%～0.53%,表明各产地间样品共有峰出峰时间较稳定,而相对峰面积的RSD值为35.08%～124.75%,说明不同产地凹叶景天正丁醇部位指纹图谱中的色谱峰之间的相对峰面积不同,各化学成分含量差异较大。相似度评价结果见表4,各产地样品的相似度在0.702～0.974,表明各产地凹叶景天正丁醇部位样品的质量相对稳定,其化学成分基本一致,各成分含量差异较大。其中浙江宁海(S1)、浙江丽水(S2)与湖北巴东县(S10)产地相似度相对较低,而其他产地样品相似度相对较高,均>0.837。

图1 凹叶景天色谱峰图

1.没食子酸;2.原儿茶酸;12.异槲皮苷。

表2 10个产地凹叶景天正丁醇部位样品共有峰相对保留时间

表3 10个产地凹叶景天正丁醇部位样品共有峰相对峰面积

表4 10个产地凹叶景天正丁醇部位指纹相似度结果

2.5统计分析

2.5.1聚类分析 运用SPSS 21.0版统计软件将10个不同产地凹叶景天正丁醇部位的样品原始数据,采用组间联接聚类方法,进行SPSS聚类分析,聚类结果见图3。当判别距离为5时,药材聚为3类,S1、S2为一类,S6、S7为一类,剩余的S3、S4、S5、S8、S9、S10为一类。聚类分析发现,10个不同产地凹叶景天正丁醇部位样品存在一定的差异,该差异可能与采收的季节、气候、土壤等外界因素有关。

图3 10个产地凹叶景天正丁醇部位样品聚类分析图

2.5.2主成分分析 将10个不同产地的凹叶景天正丁醇部位的18个共有峰的峰面积导入SPSS 21.0统计软件,进行主成分分析。计算特征值及贡献率,结果见表5,以特征值>1为提取原则,特征值>1的主成分有4个,方差贡献率分别为54.449%,18.142%,11.002%,9.884%,累计的总方差贡献率为93.447%,较全面地体现出凹叶景天正丁醇部位化学成分的基本特征。主成分分析得分图见图4,10个不同产地的凹叶景天正丁醇部位样品分为3类,S1为一类,S2、S3、S4、S5、S6、S7为一类,S8、S9、S10为一类,其结果与聚类分析结果存在差异。载荷矩阵结果见表6,主成分的贡献大小取决于载荷的绝对值大小。由表6可知,峰3,5,11,12在主成分1有较高的载荷,峰2,12在主成分2有较高的载荷,峰8在主成分3有最高的载荷,峰7,14在主成分4有最高的载荷,说明峰2,3,5,7,8,11,12,14对凹叶景天的质量贡献较大。峰2、峰12分别指认出为原儿茶酸和异槲皮苷,提示可将其作为凹叶景天的质量控制指标。推测使凹叶景天质量产生差异的不是单一的成分,可能是多个成分协同作用的结果。

图4 10个产地凹叶景天正丁醇部位样品主成分分析得分图

表5 凹叶景天正丁醇部位主成分分析的特征值与贡献率结果

表6 凹叶景天正丁醇部位主成分分析成分旋转矩阵

2.6样品含量测定

2.6.1专属性实验 为排除空白试剂干扰,以甲醇为供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样,结果表明甲醇溶剂对色谱峰的出峰情况没有干扰。

2.6.2线性关系考察 称取没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷对照品适量,精密称定,制成浓度分别为没食子酸1.061 mg·mL-1、原儿茶酸0.226 81 mg·mL-1、异槲皮苷0.342 81 mg·mL-1的混合对照溶液,用甲醇逐级稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液,按“2.1”项色谱条件进样测定。以进样浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,结果见表7。

表7 凹叶景天中3个成分线性关系考察结果

2.6.3精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液,按“2.1”项色谱条件连续进样6次,依法测定没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷的色谱峰峰面积,计算得RSD分别为1.37%,1.41%,1.43%,表明仪器精密度良好。

2.6.4稳定性实验 取S1产地凹叶景天正丁醇部位样品0.1 g,精密称定,按“2.3”项下的方法制备供试品溶液,按“2.1”项下的色谱条件分别于供试品溶液制备后 0,2,4,9,20,22,24 h进样,依法测定各色谱峰峰面积,计算得没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷RSD分别为0.90%,2.49%,0.66%,表明供试品溶液稳定性良好。

2.6.5重复性实验 称取S1产地凹叶景天正丁醇部位样品共6份,每份0.1 g,精密称定,按“2.3”项下的方法制备供试品溶液,以“2.1”项下色谱条件测定,依法测定各色谱峰峰面积,计算含量,计算得没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷的RSD值分别为1.97%,1.82%,2.01%,表明该方法的重复性良好。

2.6.6没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷加样回收实验 取已知含量的S1产地凹叶景天正丁醇部位样品共6份,每份0.05 g,精密称定,按“2.3”项方法制备对照品溶液及供试品溶液,每份加入适量混合对照品溶液,以“2.1”项下色谱条件测定,计算得平均回收率分别为97.43%,97.38%,100.25%,RSD分别为3.02%,1.38%,2.59%。

2.6.7没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷样品含量测定 取10个不同产地凹叶景天正丁醇部位样品0.1 g,按“2.3”项方法制备对照品溶液及供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样,依法测定各样品峰面积,根据外标法计算10个不同产地中没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷的含量,结果见表8。

表8 10个不同产地凹叶景天正丁醇部位样品中3种成分的含量测定结果

3 讨论

3.1指纹图谱结果分析 本研究采用HPLC法建立10批凹叶景天正丁醇部位的指纹图谱,标定18个共有峰,指认其中3个成分,分别为没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷。除了浙江宁海(S1)、浙江丽水(S2)与湖北巴东县(S10)产地外,其他产地样品相似度均>0.837,表明样品中的化学成分一致性较好。聚类分析与主成分分析都将样品分为3类,两者的分类结果却不尽相同,有差异,这可能是由于主成分分析所提取出的主成分还没能完全反映药材的全部信息有关[28-29]。同时,主成分分析载荷图提示特征性成分没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷在区分凹叶景天正丁醇部位指纹图谱中占有重要地位。没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷几个成分都具有一定药理活性,且其药理活性与凹叶景天的功效相关,为进一步研究凹叶景天药材中化学成分与药效的相关性以及药材资源开发和质量控制提供研究基础。凹叶景天药材分布于全国大部分地区,本研究由于实验时间限制等因素影响,未能采集和购买到更多其他省份和产地的凹叶景天药材,在今后的研究中可增加更多全国其他地区的药材进行研究,增加凹叶景天质量控制与评价的可靠性,确保其建立指纹图谱的广泛性,使研究结果更具有代表性。

3.2含量测定结果分析 本研究所测得10个不同产地凹叶景天正丁醇部位样品中的3种成分的含量存在一定的差异,且10个不同产地凹叶景天正丁醇部位样品中没食子酸、原儿茶酸、异槲皮苷含量的高低顺序大体上呈现出:异槲皮苷>没食子酸>原儿茶酸,且3种成分中原儿茶酸、异槲皮苷含量最高产地为浙江宁海,没食子酸含量最高的产地为广西隆安县。广西龙胜产地没食子酸含量最低,为0.275 4 mg·mL-1。湖北巴东县产地的原儿茶酸含量最低,为0.0320 mg·mL-1。广西武鸣产地的异槲皮苷含量最低,为0.647 7 mg·mL-1。

中药指纹图谱具有整体性和模糊性两大特征,中药材组成成分复杂,具有多样性和可变性,且成分间相互作用具有难以预测性。凹叶景天正丁醇部位指纹图谱相似度评价是对不同产地凹叶景天正丁醇部位质量整体性和一致性的评价,相似度结果体现的是凹叶景天药材正丁醇部位各方面的平均水平,相似度低说明该产地的凹叶景天与其他产地的凹叶景天存在较大差异,但差异的产生因素不一定是含量的差异,可能是多方面的影响。如本实验相似度评价结果与含量测定评价结果中显示S1产地相似度低,但指标成分含量高。同时凹叶景天含量存在差异也受多种因素影响,生境因子(经纬度和海拔)、生长性状等因素与指标成分含量积累关系密切[30],产地、气候条件、采收时间和季节等各种因素影响,也会造成不同产地间药材含量差异大。

综上所述,合适的生境因子(经纬度和海拔)及生长性状、合适的产地、采收时间和气候条件等对获得较高质量的药材有重要意义。本研究中不同产地凹叶景天正丁醇部位质量差异大,说明了对凹叶景天药材的质量评价方法不能从某一个指标或几个指标对其进行质量控制,且凹叶景天用药多以整体入药,为保证其用药疗效及能整体表征凹叶景天的成分和质量差异,在今后的研究中应寻找更多遵循中药质量标志物原则的指标成分进行同时测定,提高凹叶景天质量的一致性与可控性。

本研究以10个不同产地的凹叶景天为研究对象,通过HPLC法建立凹叶景天正丁醇部位的指纹图谱模式并结合化学计量学对凹叶景天进行质量评价分析,建立HPLC法同时测定凹叶景天正丁醇部位中没食子酸、原儿茶酸和异槲皮苷3个成分的含量。该研究方法操作简便,结果可靠,精密度、重复性、稳定性较好,为凹叶景天活性成分的研究奠定实验基础,为进一步研究该药材成分与药效的相关性,以及为凹叶景天的开发利用和质量评价奠定基础。