山地虎耳草质量控制方法研究*

苏媛,刘安平,刘学良,李维业,刘海青,石春兰,问静,王永晶,牛贵姗,王开祥,韩达斌,杨增亮,祁彦凯

(1.西宁市食品药品检验检测中心,西宁 810007;2.青海省药品审评核查中心,西宁 810007)

山地虎耳草在《中国植物志》[1]、《青海植物志》[2]、《青海经济植物志》[3]《中华藏本草》[4]均有记载,为虎耳草科虎耳草属山地虎耳草SaxifragamontanaH.Smith的干燥全草[1]。其藏语名为“塞仁交木”[1]、“塞交塞保”[3]、“塞迥色保”[4],生长于海拔3200～4800 m的灌丛和高山草甸,青海省内主产于海北、海南、黄南、玉树、果洛等州及东部农业区;甘肃、陕西南部、西藏、四川西部和云南北部也均有分布[3]。于每年7—8月采花或全草,洗净,晾干[4],全草入药,消炎镇痛,治头痛头伤等。经项目组调研整理发现,虎耳草属山地虎耳草在青海、甘肃、西藏等地区也常被归为“蒂达”(俗称“藏茵陈”)类药材使用[5]。目前,关于山地虎耳草化学成分研究方面的文献较少,主要集中在药材资源整理、调查等方面[6-13],笔者尚未发现其有效成分分离鉴定、质量控制等方面的文献报道,而“蒂达”类药材,如黄花獐牙菜、篦齿虎耳草的主要成分研究报道中涉及金丝桃苷及当药醇苷等成分的含量测定[8,14-15]。本研究建立薄层色谱法鉴别金丝桃苷,高效液相色谱法同时测定金丝桃苷、当药醇苷含量的测定方法,为山地虎耳草的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪,Waters 2998 PDA detector型二极管阵列检测器(美国沃特斯有限公司);ME204电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,感量:0.1 mg];XS105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司,感量:0.01 mg);SB25-12DT新芝超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q2355超纯水机(美国密理博公司)。

1.2试剂 金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111521-201809,含量:94.9%);当药醇苷对照品(成都普菲德生物技术有限公司,批号:19041505,含量:99.27%)。甲醇(色谱纯,德国默克股份两合公司,批号:I1148507118),乙腈(色谱纯,德国默克股份两合公司,批号:JA098730),磷酸(色谱纯,上海安谱科学仪器有限公司,批号:20510018),其余试剂为分析纯;水为超纯水;硅胶GF254预制薄层板(青岛海洋化工有限公司,批号:20211221)。

1.3样品 12批实验用山地虎耳草药材均由项目组人员分别于青海贵德县拉脊山、湟中县、同德县、互助县采集,经青海省药品审评核查中心刘海青主任药师鉴定。样品来源见表1,各批样品经粉碎后过孔径(355±13) μm(三号)筛密封保存备用。

表1 山地虎耳草来源

2 方法与结果

2.1金丝桃苷薄层色谱鉴别 分别取样品粉末约1.5 g,加丙酮30 mL,超声处理(250 W,50 kHz)20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。再取金丝桃苷对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502)实验,吸取上述13种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(20：12：4：4)上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以含1%亚硝酸钠的1%甲醇溶液,加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(波长365 nm)下检视。结果见图1。供试品色谱中,在与金丝桃苷对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。

1.对照品;2～13.山地虎耳草样品(SDHEC1～SDHEC12)。

2.2金丝桃苷和当药醇苷含量测定

2.2.1色谱条件与系统适用性实验 Waters SunFire C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以乙腈为流动相A,水(含0.05%磷酸)为流动相B,进行梯度洗脱(0～10 min,90%→88% A;10～20 min,88%→85% A;20～25 min,85%→82% A;25～30 min,82%→76% A;30～35 min,76%→45% A;35～37 min,45%→40%A;37～40 min,40%→90%A;40～45 min,90% A);流速为1.0 mL·min-1;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。在此色谱条件下金丝桃苷、当药醇苷与样品中其他成分分离度均>1.5,理论板数按金丝桃苷、当药醇苷峰计算分别不低于83 000和23 000。见图2。

A.空白溶剂;B.对照品;C.样品;1.金丝桃苷;2.当药醇苷。

2.2.2对照品储备溶液的制备 取金丝桃苷对照品和当药醇苷对照品,精密称定,分别为0.049 82 g和0.018 12 g,置10 mL量瓶,加甲醇超声使溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得。对照品储备溶液浓度分别为4.982,1.812 mg·mL-1。

2.2.3供试品溶液的制备 分别取“1.3”项下制备的样品粉末约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25.00 mL,称定质量,超声处理30 min(功率250 W,频率50 kHz),取出,放至室温,再称定质量,用甲醇补足减失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.4线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下金丝桃苷和当药醇苷对照品储备溶液各0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,3.00 mL,置50 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,制成混合对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行分析,以峰面积积分值(Y)为纵坐标,对照品进样量(X)为横坐标,绘制标准曲线,金丝桃苷、当药醇苷的回归方程、相关系数分别为Y=2 987 259.52X-2 091.48(r=0.999 9),Y=6 665 003.60X-558.68(r=0.999 9)。进样量分别在0.124 6～1.494 6 μg,0.045 3～0.543 6 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

按“2.2.1”项下色谱条件进行分析,当信噪比(S/N)为3时对各组分最低检出限进行测定,当S/N为10时对各组分定量限进行测定,结果表明金丝桃苷、当药醇苷的最低检出限分别为0.498,0.272 ng,定量限分别为1.993,0.680 ng。

2.2.5精密度实验 精密吸取“2.2.4”项下对照品混合溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行分析,连续进样6次,计算峰面积RSD分别为金丝桃苷0.65%,当药醇苷0.60%(n=6)。结果表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性实验 取“2.2.3”项下同一供试品溶液(样品编号:SDHEC11),分别在0,2,4,8,16,24 h按“2.2.1”项色谱条件进行分析,进样体积均为10 μL,记录峰面积,结果金丝桃苷峰面积RSD为0.32%,当药醇苷峰面积RSD为1.59%(n=6)。结果表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.2.7重复性实验 取山地虎耳草样品(样品编号:SDHEC11)6份,按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进行分析,测定金丝桃苷、当药醇苷的平均含量分别为0.438 3%,0.003 8%,RSD分别为0.77%,2.03%(n=6)。结果表明该方法重复性良好。

2.2.8回收率实验 取山地虎耳草样品(样品编号:SDHEC11)6份,每份约0.1 g,精密称定,置锥形瓶中;精密量取“2.2.2”项金丝桃苷和药醇苷对照品储备溶液1.25,0.10 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀;分别在6份供试品中精密加入上述対照品混合溶液1.00 mL,按“2.2.3”项方法制成供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进行分析,测得金丝桃苷、当药醇苷的量,计算加样回收率,平均回收率分别为93.01%,90.95%;RSD分别为0.72%,1.27%(n=6)。结果表明该方法的回收率良好。

2.2.9样品含量测定 分别取“1.3”项下制备的样品粉末约0.2 g,精密称定,按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液,然后按“2.2.1”项色谱条件进行分析,经二极管阵列检测器检测检测以上2种待测成分,比对样品与对照品紫外光谱一致后,按外标法以峰面积积分值计算,得2种待测组分的百分含量,见表2。

表2 山地虎耳草中金丝桃苷和当药醇苷含量测定结果

3 讨论

3.1指标成分的选择 本项目前期研究对山地虎耳草进行化学成分分离分析,成功分离出獐牙菜苦苷、绿原酸、当药苷、金丝桃苷和当药醇苷5种成分。分析结果显示,12批样品中仅3批检出当药苷,不同批次的样品5种成分的含量质量分数分别是0.026 6%～0.245 2%,0.032 1%～0.389 6%,0.017 1%～0.057 1%,0.201 4%～0.762 8%和0.004 1%～0.227 3%,其中獐牙菜苦苷和绿原酸虽然平均含量较大,但不同批次样品中含量差别显著。相比之下,选择金丝桃苷和当药醇苷2种成分作为检测指标,对山地虎耳草的实验室质量控制、生产加工和临床用药指导更有实际意义。

另一方面,在藏、蒙医药临床应用中,山地虎耳草被广泛作为“蒂达”类常用药材,全草入药,具有清热利胆、舒肝健胃、解毒等功效,临床上常用于治疗急性黄疸型肝炎、胆囊炎、流行性感冒等疾病[16];现代药理实验证明金丝桃苷能显著提高抗氧化酶的活力,在保护心脑缺血-再灌注损伤的同时,能增强免疫,保护肝脏,抗抑郁[17-18],还具有抗乙型肝炎病毒[19-20]、抗炎症与抗血栓作用[21];当药醇苷主要功能是减轻肝细胞的损伤,有效抑制炎症递质(肿瘤坏死因子)的形成,减轻细胞间质的炎症反应,促进受损肝细胞的修复[22];这与山地虎耳草的临床主治功能相吻合。

综合上述原因,最终确定以金丝桃苷作为薄层鉴别定性检测指标、金丝桃苷和当药醇苷作为山地虎耳草的定量检测指标。

3.2薄层色谱鉴别的考察 针对不同极性提取溶剂(甲醇、丙酮、乙酸乙酯),不同提取方法(冷浸、超声、回流),不同提取时间(10,20,30 min),不同展开剂[三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(65：35：4：1),乙酸乙酯-冰醋酸-水(8：1：1),乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(10：6：1：2)的上层溶液],不同显色剂(5%亚硝酸钠的5%甲醇溶液、三氯化铝试液),不同薄层板(硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜)进行比较考察。根据色谱分离效果、斑点显色结果,最终确定适宜的样品制备方法和薄层色谱展开条件,该条件重复性较好,层析的结果稳定,斑点清晰一致。

3.3含量测定色谱系统的优化

3.3.1测定波长的选择 采用光电二极管阵列检测器(DAD)对样品进行全波长190～800 nm扫描,对不同波长下色谱图中金丝桃苷和当药醇苷的出峰情况、峰形大小、吸收峰的数量及强弱进行对比分析,结果发现在波长254 nm下检测时,上述2种化学成分可以较好地表达,因此选择254 nm为检测波长。

3.3.2色谱柱的选择 采用3种C18色谱柱,Waters SunFire(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Shimadzu Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters XBridge(4.6 mm×250 mm,5 μm),分离金丝桃苷和当药醇苷,结果发现分离效果均较好、分离度及理论板数均达到要求,因此选择保留时间短的色谱柱。

3.3.3流动相体系的选择 采用3种不同梯度体系分离金丝桃苷和当药醇苷,综合比较分离效果、峰形大小等因素,最终确定以第2种梯度体系即“2.2.1”项下梯度体系作为流动相。

3.3.4提取溶剂比较 采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯3种溶剂,取样品粉末约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入上述溶液25.00 mL,称定质量,超声处理30 min。结果表明甲醇提取效率最高,因此选用甲醇作为提取溶剂。

3.3.5提取时间比较 取样品粉末约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25.00 mL,分别采用超声15,20,30,45 min提取。结果表明提取时间45 min较30 min,提取出含量并无显著上升,因此选超声提取30 min作为提取时间。

3.4结果分析 测定结果显示,不同产地、不同批次,以及不同采收期山地虎耳草中金丝桃苷、当药醇苷的含量有一定差异。青海互助县的样品中金丝桃苷含量普遍较高,3份样品平均含量为0.691 1%;当药醇苷含量较高的样品均产于青海同德县,该产地5份样品平均含量为0.102 2%;表明山地虎耳草生长的地理位置环境对其有效成分含量有一定影响,可考虑在上述区域进行采收。采收于果期的样品3中两种成分的含量明显较低,可考虑应在花期进行采收。

后续研究中将在采收时记录产地坐标和采收期的详细信息,进一步分析不同产地及不同采收期对山地虎耳草中金丝桃苷、当药醇苷含量差异的影响,并继续扩大采样范围,增加样品批次,对显微鉴别、水分、灰分及浸出物项目进行质量控制方法的探索,初步建立山地虎耳草的质量标准。

虽然各地在“蒂达”的临床使用方面已有习用药材及特色的治疗体系,且大部分地区已找到合适的优势基原品种替代品,但由于藏区部分地区交通不便以及各民族语言差异等,各地市场流通、医疗机构及制药企业使用的基原植物并不统一[23];同时,有关药材的质量、等级、有效性与安全性仍缺乏统一完善的评价标准,导致临床用药没有统一规范,药材及成药制剂出现混用乱用现象[24],存在一定的用药安全风险,为了确保更加有效、安全的临床用药,本文建立 “蒂达”类常用药材山地虎耳草的薄层色谱定性鉴别法,并采用高效液相色谱法,建立同时测定山地虎耳草中金丝桃苷和当药醇苷2种成分的定量分析方法。本研究结果利用现代检验检测技术手段,对传统藏药材进行定性、定量分析,能够客观、科学、快速、准确地作出评价,对山地虎耳草药材的生产加工、临床使用和质量控制均具有一定的参考价值,为“蒂达”类药材的综合质量评价及质量标准化的研究提供了实验数据,也为广大人民群众的用药有效性和安全性提供前期理论研究依据。