丙硫唑对不同植物病原菌的活性及降毒素作用研究

徐文昌,朱敏杰

(四川省简阳市植保植检站,四川 简阳 641400)

杀菌剂在整个植物病害防控中扮演着重要的角色,作用迅速且高效稳定,杀菌剂的生产和使用量占比在逐年加大[1]。近年来杀菌剂新品种的开发取得很大进展,如三唑类、酰胺类、嘧啶胺类、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等,其特点是不仅活性高、作用机理独特、对环境友好[2-3]。但随着杀菌剂应用比例的增长,植物病原菌的抗药性也逐渐增强,因此仍需持续开发研究新的杀菌剂种类。丙硫唑(Albendazole)又名丙硫咪唑、丙硫多菌灵,化学名称为5-丙硫基-1-H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯,是苯并咪唑(Benzimidazole)类的衍生化合,结构如图1所示。丙硫唑最早由Gyuri和Theodorides合成,并于1977年由美国Smith Kline公司研制成功并上市,该药在临床上被广泛用于治疗蠕虫感染导致的疾病菌,对人体及动物寄生虫如线虫、吸虫、绦虫等均有很强的驱杀作用[4]。作为杀菌剂防治植物病害方面少有报道,并多以其他杀菌剂复配的形式使用。

图1 丙硫唑的结构式

小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw)引起的一种真菌性病害,在生产中造成小麦产量和品质的显著降低[5]。小麦受到赤霉菌侵染后,病菌会迅速在穗部扩展,在籽粒灌浆成熟过程中不断繁殖生长并在籽粒中产生多种毒素[6],包括雪腐镰孢菌烯醇(NIV)化学型、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与15-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(15-ADON)化学型等,对小麦生产和人畜健康构成严重威胁[7]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是已知的单端孢霉烯族化合物中毒性最强的一种,可引起人和动物的呕吐、腹泻、头晕等的中毒症状,严重时可损害造血系统而导致死亡[8]。此外,DON具有细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性及致畴性和致癌性等,具有致癌、致畸和致突变作用[9-10]。目前尚未有报道丙硫唑影响小麦赤霉病菌产毒素量相关研究。毒素的检测方法有理化检测法、免疫化学测定法,现已建立了薄层色谱(Thin layer chromatography,TCL)、气相色谱(Gas chromatography,GC)、高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)等方法[11-12]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

FgNIV：产NIV毒素的禾谷镰孢菌(F.Graminearum)、Fg15ADON：产15AD毒素的禾谷镰孢菌(F.graminearum)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、苹果黑斑病菌(Alternariaalternata)、黄瓜褐斑病菌(Corynesporacassiicola)、葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、草坪枯萎病菌(Rhizoctoniasolani)、梨树黑星病菌(Venturiapirina)、马铃薯早疫病菌(Alternariasolani)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、小新壳梭孢菌(Neofusicoccumparvum)、以上15种病原菌由四川农业大学无公害农药研究实验室提供。

1.2 供试杀菌剂

98%丙硫唑原药、10%丙硫唑悬浮剂、75%三环唑可湿粉剂由贵州道元生物技术有限公司提供。

1.3 丙硫唑对14种不同植物病原菌的室内毒力测定

采用菌丝生长速率法[13],以丙硫唑原药作为药剂处理组,将直径为5mm的供试菌分别接种于含10个浓度梯度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL)的平皿中央,28℃恒温培养,待对照平板上菌落长到培养皿2/3左右,十字交叉法测定菌落直径(mm)计算抑制率,根据抑制率,按机率值分析法,并通过软件计算菌丝生长的EC50值。

1.4 10%丙硫唑悬浮剂对香蕉叶斑病田间防效测定

试验设3个处理：每667m2施用10%丙硫唑悬浮剂1500倍(A1),1000倍(A2)、500倍(A3)和对照药剂250g/L戊唑醇水乳剂1250倍(B)及清水对照(CK),每个处理3个重复,随机排列。除试验设计外,各处理区其他管理方式一致。施药前调查纹枯病的发病基数;分别施药3次并在末次施药的后20 d调查香蕉叶斑病发生情况,采用随机5点取样法,每个点5株苗选取中间3株,每株挂牌标记调查所有叶片的叶斑。各取样点检查每张叶片上所有病斑所占整张叶片的面积,按病斑面积比例分级记录,统计小区调查总叶片数和病级值,计算病情指数及防治效果。

香蕉叶斑病病情分级标准：0级：叶片无病斑;1级：叶片病斑面积占全叶片5%以下;3级：叶片病斑面积占全叶片6%～15%;5级：叶片病斑面积占全叶片16%～25%;7级：叶片斑面积占全叶片26%～50%;9级：叶片病斑面积占全叶片50%以上。

相对防治效率=

1.5 丙硫唑对小麦赤霉病菌毒素产生的影响

1.5.1 样品的制备 在250mL三角瓶中加入100mLGYEP培养基,每瓶接种5×104个孢子,然后于28℃,黑暗条件下,在200 rpm的摇床上培养,24h后加入相应剂量的药剂,每个菌株进行4个处理,分别为：不加药剂的空白处理、加入EC20浓度的药剂处理以及加入EC50浓度的药剂处理,每处理3次重复。继续摇培7 d后,培养物用尼龙布及滤纸过滤,得菌丝与滤液,菌丝烘干称重,滤液量得总体积并记录。取30mL滤液用等体积乙酸乙酯萃取2次,合并有机相后减压蒸馏干燥,用1mL乙腈溶解,转移到新离心管,待测。

1.5.2 样品检测 高效液相色谱分离的条件为：色谱柱为Shim-pack GIST(5μm C18,4.6×250mm);柱温25 °C;进样量5μL;流速0.8mL/min：检测波长218 nm：流动相：A为超纯水,B为乙腈,采用线性梯度洗脱：0～10min,A相为85%;10～22min,A相降为75%;22～30min,22～30min,A相升至85%。采用以上色谱条件对样品进行定性定量分析。平衡色谱柱,单次样品运行时间30min。采用以上色谱条件对样品进行定性定量分析。

液体培养基GYEP中的菌丝产量通过干菌丝称量获得。液体摇培条件下,菌株产毒素能力用单位干菌丝量的总毒素产生量来衡量,单位为μg/mL。

1.6 数据处理

采用Excel和SPSS等软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 丙硫唑对14种不同植物病原菌的室内毒力测定

通过丙硫唑对14种不同植物病原菌的室内毒力测定见表1,结果表明丙硫唑对14种植物病原菌均有一定的抑菌作用,其中对马铃薯早疫病菌、可可毛色二孢菌、小新壳梭孢菌、葡萄座腔菌有显著的抑菌作用,其EC50分别为6.1976μg/mL、6.5518μg/mL、15.4846μg/mL、20.3559μg/mL。

表1 丙硫唑对14种不同植物病原菌的室内毒力测定

2.2 10%丙硫唑悬浮剂对香蕉叶斑病的田间防效

通过表2可知,在末次施药后20d,各处理组对香蕉叶斑病的田间防治效果分别为57.76%、71.06%、80.45%、72.20%。末次药后20 d防效的差异显著性分析表明,10%丙硫唑悬浮剂的3种浓度防治效果存在极显著差异,浓度越高,防治效果越好。但10%丙硫唑悬浮剂1000倍稀释液与对照250g/L戊唑醇水乳剂1250倍稀释液间防治效果没有显著差异。

表2 10%丙硫唑悬浮剂对香蕉叶斑病的田间防效

2.3 丙硫唑对小麦赤霉病菌毒素产生的影响

2.3.1 建立标准曲线 采用高效液相色谱法同时将禾谷镰孢菌复合种的毒素NIV、DON、15ADON、3ADON分开,如图2所示,保留时间分别为NIV,4.084min;DON,6.212min;15ADON,22.190min;3ADON,26.784min。图3为色谱检测峰面积与标准工作液浓度建立的标准曲线,可见目标峰峰面积与质量浓度线性关系良好。

图2 分离4种毒素的高效液相色谱图

图3 3种毒素的标准曲线

2.3.2 丙硫唑对FgNIV产NIV毒素含量的影响 结果如表3所示,产NIV毒素的禾谷镰孢菌,分别经过EC20和EC50丙硫唑药剂处理之后,其NIV毒素积累量明显下降,相比CK对照组分别下降了17.28%和29.78%。产Fg15ADON毒素的禾谷镰孢菌,分别经过EC20和EC50丙硫唑药剂处理后,产DON、15ADON毒素积累量显著降低。产DON毒素相比CK对照组分别下降了19.69%、36.35%,产15ADON毒素相比CK对照组分别下降了19.04%、31.56%。部分样品检测图如图4。

表3 丙硫唑对小麦赤霉病菌毒素含量的影响

图4 部分样品检测图注：a：NIV-CK;b：NIV-EC20处理;c：NIV-EC50处理;d：Fg15-CK产15ADON平均浓度;e：Fg15-EC20处理产15ADON平均浓度;f：Fg15-EC50处理产15ADON平均浓度;g：Fg15-CK产DON平均浓度;h：Fg15-EC20处理产DON平均浓度;i：Fg15-EC50处理产DON平均浓度。

3 讨论

杀菌剂是目前植物病害防治中最高效的防治手段[14],丙硫唑又是一种低毒、高效的医药且在植物病害防治方面的研究较少。石娅琼[15]发现10%丙硫唑悬浮剂对辣椒炭疽病和水稻稻瘟病等病害具有抑制作用。叶火春等[16]人研究得出丙硫唑与溴菌腈复配使用对杧果细菌性角斑病菌的防治有协同增效的作用。本研究通过室内毒力测定丙硫唑对14种植物病原菌均有一定的抑菌作用,说明丙硫唑具有广谱杀菌性。10%丙硫唑悬浮剂的3种浓度防治效果存在极显著差异,浓度越高,防治效果越好。同时10%丙硫唑悬浮剂1000倍稀释液与对照250g/L戊唑醇水乳剂1250倍稀释液间防治效果没有显著差异,说明10%丙硫唑悬浮剂对香蕉叶斑病具有较好的田间防治效果。

小麦受到赤霉菌侵染后在籽粒中产生多种毒素,包括雪腐镰孢菌烯醇(NIV)脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与15-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(15-ADON)等。这类毒素具有细胞毒性,可以穿过生物屏障,影响消化、免疫、内分泌和神经系统,会引起呕吐、腹痛、眩晕等症状[17-18]。现尚未有报道丙硫唑对小麦赤霉病菌产毒素影响相关的研究,本文通过高效液相色谱法发现,产NIV毒素的禾谷镰孢菌,经过EC20、EC50丙硫唑药剂处理之后,其NIV毒素积累量明显降低,产Fg15ADON毒素的禾谷镰孢菌经EC20、EC50药剂处理后,产DON、15ADON毒素积累量明显降低,说明一定浓度的丙硫唑对小麦赤霉病菌有降毒素的作用。