丹贝酱的抗氧化活性及风味成分分析

李梦茹 杨文清 李西西 李佳莹 赵雪如 付玮琦 李风娟

摘要：丹贝是一种以大豆为原料经根霉等发酵而制得的产品，文章采用后发酵工艺对鲜丹贝进行进一步加工得到衍生产品丹贝酱，考察了丹贝酱在后发酵过程中风味物质、抗氧化能力、总酚含量、总黄酮含量和游离氨基含量的变化。结果表明，丹贝经后发酵72 h后所得丹贝酱样品水提物呈现良好的抗氧化活性，DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe3+还原能力分别为1.526，1.609，0.983 mg TE/g DW，总酚及总黄酮含量分别为1.811 mg GAE/g DW和0.113 mg CE/g DW；风味成分分析发现，后发酵72 h丹贝酱样品中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛和2-正戊基呋喃的气味活性值（OAV）较高，可被视为主要香气成分，将为具有良好功能活性及感官品质的丹贝酱及其他丹贝衍生产品的开发提供基础理论参考。

关键词：后发酵；丹贝酱；抗氧化能力；酚类物质；风味

中图分类号：TS264.24      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0015-05

Abstract： Tempeh is is a product made from soybeans through the fermentation by Rhizopus. In this paper， the fresh tempeh is further processed by post fermentation to obtain the derivative product tempeh paste. The changes of flavor components， antioxidant capacity， the content of total phenols， total flavonoids and free amino groups of tempeh paste during post fermentation are investigated. The results show that the water extract of tempeh paste obtained after post fermentation for 72 h shows good antioxidant activity， with DPPH， ABTS radicals scavenging capacity and Fe3+ reducing capacity of 1.526， 1.609， 0.983 mg TE/g DW respectively. The content of total phenols and total flavonoids is 1.811 mg GAE/g DW and 0.113 mg CE/g DW respectively. Through the analysis of flavor components， it is found that 1-octene-3-ketone， 3-octanone， 1-octene-3-alcohol， nonanal and 2-n-pentylfuran in tempeh paste samples after post fermentation for 72 h have higher odor activity values （OAV）， which could be regarded as the main flavor components， would provide basic theoretical references for the development of tempeh paste and other tempeh derivative products with good functional activities and sensory quality.

Key words： post fermentation; tempeh paste; antioxidant capacity; phenolic substances; flavor

丹贝（tempeh）是一种以大豆为原料，经少孢根霉、米根霉等微生物发酵而成的大豆发酵制品，起始于印度尼西亚。与大豆相比，丹贝中氨基酸种类、大豆异黄酮苷元、烟酸、核黄素和维生素B12等生物活性成分均有所提高[1-2]。现代研究发现，丹贝具有抗菌、抗氧化等生理调节功能[3-4]。丹贝在日本、欧洲、北美等发达国家和地区已日趋流行，对其衍生产品的研究也日益受到关注。

后发酵是发酵食品加工的一个重要工艺流程，指经过前发酵處理，物料在一定的温度、时间等条件下，由微生物和酶的共同作用，对发酵基质中的大分子物质进行进一步分解，发生新的生化反应，从而有助于产品独特风味、质地和组织状态的形成，比如豆瓣酱、腐乳、酸奶等发酵食品在加工时所经历的后熟过程[5]。有报道指出，豆豉的后发酵过程是改变其外观状态、形成独特风味、增强生物活性、提高营养成分的关键工艺[6]；豆瓣在后熟过程中通过添加一定比例的水、辣椒和食盐后，在微生物和酶的作用下形成其特有的风味[5]；茶经过后发酵处理，茶中的刺激物质减少，滋味醇厚甘甜，茶性平和，这为开发丹贝衍生产品提供了新的思路。

本研究对鲜丹贝进行后发酵处理制得丹贝酱产品，考察了丹贝酱在后发酵过程中抗氧化能力、总黄酮、总酚和游离氨基等的变化，并对其风味成分进行了分析，旨在为丹贝酱的研发提供理论指导，并促进丹贝衍生产品的开发及大豆发酵食品的进一步发展。

1 材料与方法

1.1 样品材料

去皮大豆：购于潍坊市天下粮仓食品有限公司；少孢根霉（Rhizopus oligosporus）：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要试剂及仪器设备

1.2.1 主要试剂

2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde， OPA）、没食子酸（GA）、儿茶素（C）、Folin-Ciocalteu试剂：购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.2.2 主要仪器

Model 1680酶标仪 瑞士Tecan公司；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

通过浸泡大豆、蒸煮、调酸、降温、接种（孢子悬浮液浓度7.36×106 CFU/mL）、装袋（扎孔）、前发酵（42 h）制作丹贝。将发酵好的丹贝切成小块，加盐水调制混匀（丹贝酱终产品含盐量为4%），放于灭菌的玻璃罐中，将玻璃罐密封后放入30 ℃恒温培养箱中，后发酵24，48，72 h后分别取样。

1.3.2 样品水提物的制备

称取冻干后打粉的0.5 g丹贝酱粉末样品与5 mL蒸馏水于10 mL离心管中混合，振荡2 min，超声5 min，30 ℃摇床1 h，然后于3 800 r/min离心15 min，用注射器吸取上清液后过0.45 μm滤膜得到样液，样品浓度标记为100 mg/mL。

1.3.3 抗氧化活性的测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

参照Brand-Williams等[7]的方法。取5 μL浓度为25 mg/mL的样液和195 μL浓度为0.079 mg/mL的DPPH反应液混合并于暗处反应30 min，测定517 nm波长下的吸光值，计算清除率，用Trolox为标准，将样品结果表示为Trolox的毫克数（mg TE/g DW）。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力的测定

参照高一芳等[8]的方法。取5 μL浓度为25 mg/mL的样液和200 μL的ABTS反应液混合反应30 min，测定732 nm波长下的吸光值，计算清除率，样品结果表示为Trolox的毫克数（mg TE/g DW）。

1.3.3.3 FRAP还原能力的测定

参照高一芳等[8]的方法。取10 μL浓度为50 mg/mL的样液和145 μL的TPTZ反应液混合后于37 ℃反应10 min，测定593 nm波长处的吸光值，样品结果表示为Trolox的毫克当量数（mg TE/g DW）。

1.3.4 總黄酮含量的测定

采用硝酸铝显色法，取30 μL浓度为50 mg/mL的样液依次加入132 μL蒸馏水、9 μL 5% NaNO2溶液混合反应6 min后，再加入9 μL 10% AlCl3·6H2O溶液，放置5 min，再加入120 μL NaOH溶液混合反应，测定510 nm波长处的吸光值，将样品结果表示为儿茶素的毫克数（mg CE/g DW）。

1.3.5 总酚含量的测定

取100 μL浓度为25 mg/mL的样液依次加入80 μL福林酚、80 μL 10% Na2CO3溶液混合反应，37 ℃放置1 h，测定750 nm波长处的吸光值，将样品结果表示为没食子酸的毫克数（mg GAE/g DW）。

1.3.6 游离氨基的测定

OPA反应液的配制参考丁一[1]的方法，现配现用。取10 μL浓度为5 mg/mL的样液，加入200 μL OPA反应液混合，暗反应2 min，以蒸馏水为对照，测定340 nm波长处的吸光值。以L-亮氨酸为标准，样品游离氨基含量表示为g/100 g。

1.3.7 顶空固相微萃取及气相色谱-质谱（GC-MS）检测

将萃取头（75 μm CAR/PDMS）于250 ℃的进样口进行老化30 min的预处理。称取4 g丹贝酱样品于微萃取瓶中，加1 μL稀释的2-甲基-3-庚酮，拧好封盖，将磁力搅拌器调至60 ℃预热10 min，萃取头在60 ℃顶空吸附30 min。

程序设置：初温40 ℃，持续3 min；终温250 ℃，持续6 min，运行总时间50 min。进样口温度：250 ℃，载气为He，流速为1 mL/min。电离方式为电子轰击（EI）离子源，电离电压70 eV，接口温度220 ℃，离子源温度200 ℃，质量扫描范围35～500 amu。

1.3.8 风味物质的定性、定量标准

1.3.8.1 定性标准

第一，通过NIST 11谱库分析，将检测到的风味物质与NIST 11标准谱库对比匹配，初步筛选风味物质；第二，根据风味物质在DB-WAX色谱柱上的线性保留指数（retention index，RI）计算获得。

1.3.8.2 定量标准

采用面积归一化法计算待测样品风味物质的相对含量，并用内标法（内标为2-甲基-3-庚酮）精确定量丹贝中的风味物质。

1.3.9 气味活性值

目前结合风味物质的阈值及其在体系中的浓度，是精确衡量其对食品贡献大小的方法，即气味活性值（odor activity value，OAV）。通常OAV≥1表示其对风味具有贡献作用。风味物质的阈值通过已发表的书籍查询。

1.3.10 统计分析

每组实验重复测定3次。使用Origin 2019b绘制图形，使用SPSS Statistics 26进行方差分析（P<0.05）。

2 结果与讨论

2.1 后发酵过程中丹贝酱的抗氧化活性

丹贝酱后发酵过程中抗氧化能力的变化见图1。

后发酵72 h丹贝酱样品水提物的DPPH、ABTS自由基清除能力及Fe3+还原能力分别为1.526，1.609，0.983 mg TE/g DW，为样品最高含量，随着后发酵时间的延长，其DPPH、ABTS自由基清除能力和Fe3+还原能力均呈先降低后升高的趋势。

丹贝中抗氧化物质主要是酚酸类、黄酮类、小分子肽、多糖和氨基酸类物质[9-12]。在后发酵过程中，丹贝酱中氨基酸可能与还原糖发生反应产生具有清除自由基能力的蛋白黑素类物质[13-14]，而丹贝酱抗氧化能力的变化可能是由于后发酵过程中丹贝酱中的酶活或蛋白酶水解程度改变，从而改变小分子肽的形成，因而对不同后发酵时间的丹贝酱样品的抗氧化能力产生影响。

2.2 后发酵过程中丹贝酱的总黄酮、总酚含量

丹贝酱后发酵过程中总黄酮和总酚的含量变化见图2。

后发酵48 h丹贝酱样品水提物中总黄酮含量为0.147 mg CE/g DW，但随着后发酵过程的进行，总黄酮含量略有下降；丹贝酱样品水提物中总酚含量随着后发酵时间的延长呈上升趋势，后发酵72 h样品的总酚含量为1.811 mg GAE/g DW，为样品最高含量。酚类化合物通常以糖苷的形式和糖（主要是葡萄糖）结合，在后发酵过程中，β-葡萄糖苷酶、蛋白酶等由微生物分解代谢产生的水解酶物质可促进酚类游离态产物的形成，如葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的糖苷键，释放出游离异黄酮苷元[15－16]，从而增加总黄酮含量，β-葡萄糖苷酶亦可催化丹贝底物释放可提取的游離酚类化合物[17]，从而使总酚含量上升。

2.3 后发酵过程中丹贝酱的游离氨基含量

丹贝酱后发酵过程中游离氨基含量的变化见图3。

随着后发酵过程的继续，丹贝酱样品水提物中的游离氨基含量呈上升趋势，后发酵72 h样品中游离氨基含量最高，为0.231 g/100 g。在后发酵过程中，少孢根霉继续增殖，蛋白酶活升高，其次，食盐的添加使少孢根霉处于低氧环境，这为其发生应激反应分泌蛋白酶创造了条件，进一步促使蛋白质被分解为多肽及小分子氨基酸，使得游离氨基含量逐渐升高[18]。

2.4 后发酵过程中丹贝酱挥发性风味物质分析

2.4.1 主要挥发性物质OPLS-DA和差异物质分析

通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）后发酵丹贝酱中的主要挥发性物质，由图4中a可知，丹贝酱每个组平行之间没有较大差异。

由图4中b可知，丹贝酱中的主要风味差异物质有11种，分别为1-辛烯-3-酮、正辛醛、乙醇、3-辛酮、2-正戊基呋喃、1-辛烯-3-醇、3-甲基-3-丁烯、1-石竹烯、2-乙基己醇、2，3-丁二醇、壬醛。丹贝酱中戊醛、己醛、正辛醛、2-正戊基呋喃和1-辛烯-3-醇等风味物质可能由亚油酸降解产生[19-20]；2，3-丁二醇可能与美拉德反应或者氨基酸的生物合成有关[21-22]；2-庚酮、1-辛烯-3-酮可能由微生物脂肪酶和氢过氧化物酶诱导的脂质氧化产生。

2.4.2 OAV分析

通过精确查找所检测出的风味物质的阈值，结合GC-MS的物质含量结果，计算出各物质的气味活性值。当OAV≥1时，认为该物质对食品的风味具有一定贡献，故对后发酵丹贝酱样品的OAV进行进一步研究，将有助于挖掘后发酵丹贝酱中的关键香气成分。丹贝酱后发酵过程中气味活性值热图见图5。

丹贝酱后发酵过程中，后发酵24 h时样品中OAV≥1的风味物质有22种，其中1-辛烯-3-酮、3-辛酮（有果实香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇的清香）的OAV较高；后发酵48 h时样品中OAV≥1的风味物质有11种，其中1-辛烯-3-酮、正辛醛、1-辛烯-3-醇的OAV较高；后发酵72 h时样品中OAV≥1的风味物质有20种，其中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛（具有玫瑰、柑橘等香气）的OAV较高，这些香气成分对丹贝酱制品的风味具有重要贡献。

3 结论

鲜丹贝经后发酵工艺处理后所得丹贝酱呈现良好的抗氧化活性，其中后发酵72 h时丹贝酱样品水提物的DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe3+还原能力及总酚、游离氨基含量最高，且检测到OAV≥1的风味物质有20种，1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛和2-正戊基呋喃对产品的风味产生有重要影响。后续研究将进一步考察后发酵过程中含盐量、温度等工艺参数对样品功能品质、活性物质及风味成分生成的影响，为深入开发丹贝衍生品、推动大豆发酵食品产业发展提供更丰富的理论支撑。

参考文献：

[1]丁一.添加谷物的新型丹贝研发及其抗氧化活性评价[D].南京：南京农业大学，2012.

[2]WOLKERS-ROOIJACKERS J C M， ENDIKA M F， SMID E J. Enhancing vitamin B12 in lupin tempeh by in situ fortification[J].LWT-Food Science and Technology，2018，96：513-518.

[3]SOKA S， SUWANTO A， RUSMANA I， et al. Analysis of intestinal mucosal immunoglobulin A in Sprague Dawley rats supplemented with tempeh[J].Hayati Journal of Biosciences，2015，22（1）：48-52.

[4]NAKAJIMA N， NOZAKI N， ISHIHARA K， et al. Analysis of isoflavone content in tempeh， a fermented soybean， and preparation of a new isoflavone-enriched tempeh[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100（6）：685-687.

[5]黄璐.混合菌株发酵及后熟对丹贝品质和功能特性的影响[D].南京：南京农业大学，2018.

[6]王迪，王智荣，陈湑慧，等.不同后发酵温度下曲霉型豆豉的氨基酸态氮生成动力学及品质变化研究[J].食品与发酵工业，2021，47（9）：91-99.

[7]BRAND-WILLIAMS W， CUVELIER M E， BERSET C. Use of afree radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28：25-30.

[8]高一芳，刘雪婷，闫仲丽，等.牡丹花水提物对肾素和ACE的双重抑制作用[J].现代食品科技，2021，37（2）：114-119，260.

[9]张嵘，相启森，王利敏，等.植物多酚在肉及肉制品中的应用研究进展[J].中国调味品，2021，46（10）：183-187.

[10]BAGHERI N， LAWATI H A J， HASSANZADEH J. Simultaneous determination of total phenolic acids and total flavonoids in tea and honey samples using an integrated lab on a chip device[J].Food Chemistry，2021，342：128338.

[11]吕明帅，赵博，孙文玉，等.富硒黑木耳多糖的理化性质及抗氧化活性研究[J].中国调味品，2021，46（6）：54-59.

[12]JOHN J A， SHAHIDI F F. Phenolic compounds and antioxidant activity of Brazil nut （Bertholletia excelsa）[J].Journal of Functional Foods，2010，2（3）：196-209.

[13]时培宁，谭笑，李瑩，等.功能性调味黑蒜液加工中品质变化研究[J].中国调味品，2021，46（10）：47-53.

[14]商全乐，白迎秋，彭一腾.陈醋多酚提取物抗氧化活性及抗疲劳作用研究[J].中国调味品，2020，45（7）：168-171.

[15]KULIGOWSKI M， PAWLOWSKA K， JASIN＇SKA-KULIGOWSKA I， et al. Isoavone composition， polyphenols content and antioxidative activity of soybean seeds during tempeh fermentation[J].CyTA-Journal of Food，2016，15（1）：27-33.

[16]王丹丹.黑豆丹贝的研制及生理活性物质的研究[D].太原：山西农业大学，2013.

[17]LEE I H，HUNG Y H， CHOU C C. Solid-state fermentation with fungi to enhance the antioxidative activity， total phenolic and anthocyanin contents of black bean[J].International Journal of Food Microbiology，2008，121（2）：150-156.

[18]JANIC＇ANIC＇ H E， TOMIC＇ J， TORBICA A， et al. Content of free amino groups during postharvest wheat and flour maturation in relation to gluten quality[J].Food Chemistry，2014，164：158-165.

[19]YANG Y， WANG B， FU Y， et al. HS-GC-IMS with PCA to analyze volatile flavor compounds across different production stages of fermented soybean whey tofu[J].Food Chemistry，2021，346：128880.

[20]WANG M Q， MA W J， SHI J， et al. Characterization of the key aroma compounds in Longjing tea using stir bar sorptive extraction （SBSE） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）， gas chromatography-olfactometry （GC-O）， odor activity value （OAV）， and aroma recombination[J].Food Research International，2020，130：108908.

[21]FENG X M， LARSEN T O， SCHNURER J， et al. Production of volatile compounds by Rhizopus oligosporus during soybean and barley tempeh fermentation[J].International Journal Food Microbiology，2007，113（2）：133-141.

[22]KROGERUS K， GIBSON B R. Influence take of valine and other amino acids on total diacetyl and 2，3-pentanedione levels during fermentation of brewer's wort[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（15）：6919-6930.