血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平预测非小细胞肺癌患者术后预后的效能

戴 斌,曾颖鸥,乔 弟,邬云龙,王 勐,王 强

上海市浦东新区周浦医院胸外科,上海 201318

肺癌是最常见的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%,由于该病发病较为隐匿,在确诊时大多数患者已处于中晚期,总体生存率仍较低,5年生存率仅为15%～17%[1]。因此,发掘早期诊断和筛查肺癌的指标,对于改善患者预后具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,长度为 20～22 nt,广泛存在于真核细胞中, 越来越多的研究证实,miRNA在癌症发展过程中发挥着重要作用,可能涉及细胞增殖、转移和凋亡[2]。研究证实miRNA与肺癌具有一定的联系,miR-1246通过与CXC趋化因子受体4(CXCR4)结合具有抑制肺癌迁移和上皮间质转化的作用,但其在肺癌预后评价中的价值仍不清楚[3]。本研究通过检测NSCLC患者血清miR-1246、趋化因子基质细胞衍生因子-1(CXCL12)和CXCR4水平,分析3项指标预测NSCLC预后的价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年1月至2020年6月在本院接受手术治疗的98例NSCLC患者为NSCLC组,其中男72例,女26例;年龄45～79岁,平均(59.85±6.73)岁,病理类型包括腺癌35例,鳞癌44例,其他19例;分化程度包括低分化37例,中高分化61例;临床分期Ⅰ期15例,Ⅱ期47例,Ⅲ期28例和Ⅳ期8例;有淋巴结转移55例,无淋巴结转移43例。纳入标准:所有NSCLC均经病理检查证实;临床资料完整;术前未接受放疗和化疗。排除标准:存在其他部位转移性肿瘤;术前接受过放疗或者化疗;合并血液性和免疫性疾病;合并心、肝、肾等重要脏器功能不全;合并肝炎、结核和肺部急慢性感染;存在智力障碍或者精神疾病。选择同期在本院诊断为肺部良性疾病的75例患者为肺良性疾病对照组,其中男53例,女22例;年龄45～79岁,平均(58.18±6.28)岁。纳入同期本院75例健康体检者为健康对照组,其中男55例,女20例;年龄45～79岁,平均(58.28±7.03)岁。3组年龄、性别等基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有研究对象签署知情同意书,本研究经本院医学伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1血液标本收集 NSCLC患者入院后(术前)和手术后7 d(术后),肺良性疾病患者入院当日,健康体检者体检当日抽取肘静脉血约5 mL,在室温下静置约20 min,然后以3 000 r/min离心10 min,离心半径为15 cm,取上清液约3 mL,放置在-80 ℃的冰箱中待测,采用酶联免疫吸附试验检测血清CXCL12和CXCR4水平。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 采用TaqMan miRNA试剂盒提取细胞总的RNA,采用qRT-PCR检测血清中的miR-1246水平。并根据目标基因的mRNA序列,设计引物,采用Primer express 3.0软件设计的反转录产物为模板。miR-1246扩增引物序列如下:正向引物5′-CCUGCUCCAAAAAUCCAUU-3′;反向引物5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′。U6扩增引物序列如下:正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;反向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反转录后以反转录产物为模板,采用qRT-PCR仪进行扩增,反应条件为85 ℃ 3 min,85 ℃ 20 s,42 ℃ 40 s,总共循环35次,采用2-ΔΔCt计算miR-1246水平。

1.2.3随访 通过查阅病史、电话、微信和门诊复查等方式对NSCLC患者进行随访,每例患者均随访两年,主要了解患者是否有NSCLC复发、转移和死亡等不良预后情况,并将患者分为预后良好组和预后不良组。

1.2.4观察指标 比较3组研究对象血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平的变化。分析血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平与NSCLC临床特征和预后的关系,以及3项指标对NSCLC术后两年内发生预后不良的预测价值。

2 结 果

2.13组血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平比较 NSCLC组术前血清miR-1246水平明显低于肺良性疾病对照组和健康对照组,肺良性疾病对照组也明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组中,术后miR-1246水平较术前明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组术前血清CXCL12和CXCR4水平较肺良性疾病对照组和健康对照组明显升高,肺良性疾病对照组明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组中,术后血清CXCL12和CXCR4水平较术前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平比较

2.2不同特征NSCLC患者3项指标水平比较 低分化、Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移的NSCLC患者血清miR-1246水平明显低于高中分化、Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴结转移NSCLC患者,差异有统计学意义(P<0.05);而低分化、Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移的NSCLC患者血清CXCL12和CXCR4水平明显高于高中分化、Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴结转移的NSCLC患者,差异有统计学意义(P<0.05);血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平在不同年龄、性别、吸烟情况、病理类型和肿瘤最大径NSCLC患者中比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同特征NSCLC患者3项指标水平比较

续表2 不同特征NSCLC患者3项指标水平比较

2.3不同预后NSCLC患者3项指标水平比较 根据患者两年的随访情况将98例NSCLC患者分为预后不良组(39例)和预后良好组(59例)。预后不良组血清miR-1246水平明显低于预后良好组,而预后不良组血清CXCL12和CXCR4水平明显高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同预后NSCLC患者3项指标水平比较

2.43项指标对NSCLC患者预后不良的预测效能 根据NSCLC患者是否发生预后不良进行二元Logistic回归分析,得方程Y=-8.45×XmiR-1246+0.46×XCXCL12+0.12×XCXCR4-5.76为联合检测指标,联合检测的灵敏度为82.1%,特异度为84.7%,曲线下面积(AUC)为0.910,其AUC明显高于miR-1246(Z=3.131,P=0.002)、CXCL12(Z=2.998,P=0.003)和CXCR4(Z=3.022,P=0.003)单独检测,而3项指标之间的AUC比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 见表4和图1。

表4 3项指标对NSCLC患者预后不良的预测效能

图1 3项指标对NSCLC患者预后不良的预测效能的ROC曲线

3 讨 论

随着分子生物学技术进步,对NSCLC发病机制的研究不断深入,研究者发现血清肿瘤标志物对NSCLC的诊断和预后评估具有重要的意义。NSCLC在发生、发展的过程中存在多种癌基因和抑癌基因相互作用,且这些基因的生物学行为表现为阶段性变化[4-5]。miRNA 在各种肿瘤中发挥着重要作用[6]。miR-1246作为miRNA家族的一名成员,已在许多癌症中被报道出现异常表达,包括卵巢癌、宫颈癌、肝癌、多发性骨髓瘤和肺癌[7-9]。一项研究表明,miR-1246在多发性骨髓瘤CD138 细胞中呈明显高表达[10]。另外,在宫颈癌和胰腺癌等肿瘤中出现 miR-1246的低表达,发挥抑癌作用[11]。本研究证实,NSCLC组术前血清miR-1246水平明显低于肺良性疾病对照组和健康对照组,并且NSCLC组术后血清miR-1246水平较术前明显升高,说明miR-1246在肺癌中是一种抑癌基因,参与了肺癌的发生、发展,在肺癌进展中为关键驱动基因。因此,血清miR-1246有成为早期发现肺癌和治疗靶标的潜力。低分化、Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移NSCLC患者血清miR-1246水平明显低于高中分化、Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴结转移NSCLC患者(P<0.05),并发现不同年龄、性别、吸烟情况、病理类型和肿瘤最大径NSCLC患者血清miR-1246水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究结果显示,预后不良组血清miR-1246水平明显低于预后良好组,且血清miR-1246为0.76时,其预测NSCLC患者两年内发生预后不良的灵敏度为89.7%,特异度为57.6%,AUC为0.785,说明其对NSCLC发生预后不良具有较高的预测效能。

一般来说,miRNA通过调节不同的靶基因参与一系列生物过程。研究表明,miR-1246通过介导不同靶基因影响癌症进程,CXCR4是miR-1246的新靶基因,并受miR-1246的负调控[3]。本研究结果显示,NSCLC组术前血清CXCR4水平明显高于肺良性疾病对照组和健康对照组,NSCLC组术后血清CXCR4水平较术前明显降低,说明CXCR4参与了NSCLC疾病的发生、发展。以往研究显示,CXCR4在多种肿瘤细胞中呈高表达,同样发现在NSCLC组织中呈高表达,并与肿瘤的恶性程度呈正相关[12]。本研究发现,不同肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移情况NSCLC患者血清CXCR4水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),并且发现预后不良组血清CXCR4水平明显高于预后良好组(P<0.05),说明血清CXCR4水平与NSCLC的预后关系密切。CXCR4不仅在肺癌原发灶中高表达,在淋巴结转移灶中同样呈高表达,而且在骨转移等破坏区域也呈高表达,在敲除CXCR4基因后能够明显抑制NSCLC在肺或者肝脏中的转移[13-14]。本研究结果显示,血清CXCR4为48.55 pg/mL预测NSCLC患者两年内预后不良的灵敏度为74.4%,特异度为74.6%,AUC为0.771,说明CXCR4水平在预测NSCLC术后发生预后不良方面具有较高的效能。

本研究结果显示,NSCLC组术前血清CXCL12水平明显高于肺良性疾病对照组和健康对照组,NSCLC患者术后血清CXCL12水平较术前明显降低,说明CXCL12水平升高与NSCLC疾病本身有关。CXCL12是重要的趋化因子超家族成员之一,能够与特异性配体CXCR4结合,激活CXCL12/CXCR4轴细胞通路,导致肿瘤细胞的增殖[15]。本研究结果显示,不同肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移情况NSCLC患者血清CXCL12水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),并且发现预后不良组血清CXCL12水平明显高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05),说明血清CXCL12水平与NSCLC患者预后关系密切。现有研究证实,CXCL12与CXCR4结合后,形成信息传递和细胞迁移的偶联分子对,参与了肿瘤新生血管的形成,能够上调基质金属蛋白酶的分泌,为肿瘤的转移提供了有利条件[16-17]。本研究结果还显示,当血清CXCL12为11.47 pg/mL时,其预测NSCLC发生预后不良的灵敏度为71.8%,特异度为74.6%,AUC为0.788,说明血清CXCL12水平在预测NSCLC预后不良方面具有较高的效能。另外,本研究结果显示,联合检测血清miR-1246、CXCL12和CXCR4在预测NSCLC患者预后不良方面具有更高的效能,其灵敏度为82.1%,特异度为84.7%,AUC为0.910,其AUC明显大于miR-1246、CXCL12和CXCR4单独检测,说明3项指标之间存在某种互补关系。

综上所述,miR-1246、CXCL12和CXCR4参与了NSCLC的发生、发展过程,联合检测miR-1246、CXCL12和CXCR4在预测NSCLC术后两年内发生预后不良方面具有较高的效能。