NK细胞联合PD-1单抗杀伤结直肠癌细胞的研究

王丙萍 段金凯 张双 高艳伟 任猛 陈良全 高维实

结直肠癌是十分常见的消化道恶性肿瘤之一。近年在全球范围内,结直肠癌的发病率及死亡率有逐渐升高的趋势,且50岁以下年轻人群发病率上升[1-2]。对于晚期患者,通常治疗后疾病有进展且预后较差。因此,探索安全、有效的结直肠癌治疗手段及策略是十分迫切的。

肿瘤免疫治疗在近年来发展迅猛,是目前癌症治疗中最受瞩目的治疗手段。关于PD-1/PD-L1抑制剂的应用在肾细胞癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、食管癌、霍奇金淋巴瘤和结直肠癌的治疗中取得了十分重大的突破,被FDA批准可以应用于临床治疗[3-7]。然而免疫检查点抑制剂在结直肠癌治疗方面的应用还处于不断探索的阶段。NK细胞过继性回输在多种癌症的治疗中取得了令人满意的效果[8]。免疫检查点抑制剂与NK细胞联合应用,在治疗白血病和非小细胞肺癌患者时是安全、有效且具有生存获益[9-10]。并且许多研究表明,NK细胞在PD-1信号通路阻断疗法中发挥着十分重要的作用。

本研究通过检测NK细胞及PD-1单抗+NK细胞杀伤五种结直肠癌细胞系的效率及最佳效靶比,探讨PD-1抑制剂联合NK细胞回输治疗结直肠癌的可行性,为探索结直肠癌治疗策略提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

结直肠癌细胞株LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115和HRT-18购自中国科学院上海细胞所;Lonza X-VIVO15培养基、DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、F-12K培养基、McCoy′s5A培养基、胎牛血清、胰酶、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司;诱导剂IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、OKT3购自美国R&D公司;抗人CD16单克隆抗体购自中国北京同立海源生物科技有限公司;PD-1单克隆抗体(Nivolumab)购自中国大连美仑;Ficoll淋巴细胞分离液购自中国TBDTM公司;荧光标记单克隆抗体:CD3-FITC、CD56-PE、鼠抗人IgG-FITC购自美国BD公司;CCK-8试剂盒购自中国博士德生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 结直肠癌细胞株的培养 LOVO、Caco-2、HT-29结直肠癌细胞株的培养液分别为F-12K、RPMI-1640、McCoy′5A培养基,HT-115和HRT-18结直肠癌细胞株的培养液均为DMEM高糖培养基,FBS浓度均为10%。细胞培养至贴壁90%左右传代培养,0.25%胰蛋白酶在37℃时消化的时间分别是LOVO、HT-29、HT-115为2 min,Caco-2为1.5 min、HRT-18为3 min。

1.2.2 外周血单个核细胞(PBMCs)分离 Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs,收集血浆,置于56℃水浴锅内保持30 min,之后置于4℃冰箱内10 min进行冷却,离心后收集上清保存于4℃备用;收集白膜层,加入PBS清洗,离心弃上清液,用VIVOTM15培养基重悬PBMCs细胞,显微计数,取样进行流式检测。

1.2.3 NK细胞的诱导扩增 接种日期为第0天,调整PBMCs细胞密度为1.5 M/mL,加入自体血清10%,IL-2 1 000 IU/mL,IL-7 10 ng/mL,IL-15 50 ng/mL,IL-18 10 ng/mL,IL-21 50 ng/mL,OKT3 10 ng/mL,Anti-CD16 10 ng/mL,90% VIVOTM15培养基培养细胞,细胞接种密度≤1.5 M/mL,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。第3～14天补液:每次补液调整细胞密度为0.5～1.0 M/mL,自体血浆10%,加入IL-2 1 000 IU/mL。第14天收获:流式细胞仪检测结果,合格后收获细胞。

1.2.4 流式细胞检测 免疫荧光标记法进行流式细胞分析,取NK细胞PBS洗涤后悬浮细胞,加入CD3-FITC和CD56-PE,4℃避光孵育30 min。PBS洗涤后流式细胞仪分析检测,用异硫氰酸(FITC)标记IgG作为阴性对照,根据流式细胞分析图中CD3-CD56+的百分比,确定NK细胞所占比例。

1.2.5 CCK-8法检测杀伤效率 分别以NK细胞、NK+PD-1单抗为效应细胞,靶细胞分别为五种结直肠癌细胞系。靶细胞接种培养12 h后,加入效应细胞。NK+PD-1单抗为效应细胞的处理方式是106个NK细胞加入6 μg PD-1单抗在培养箱中培育2 h。两组均按效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例分别加入效应细胞为实验组,同时设置单独靶细胞孔和每种比例的单独效应细胞孔,3个复孔。共同培养24 h后,加入CCK-8试剂孵育3.5 h后用酶标仪测定450 nm波长的OD值,以此方法检测NK细胞的细胞毒活性,公式如下:

杀伤率(%)=[1-(实验组OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞组OD值]×100%。

1.2.6 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行数据统计分析,组内比较采用两因素方差分析,组间比较采用方差分析结合事后检验Bonfferoni法进行两两比较,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NK细胞的培养结果

健康人外周血分离PBMCs后,经细胞因子诱导扩增NK细胞。第0天为散落的颗粒状细胞(图1A),3～4天后聚集成团,出现细胞集落(图1B),培养10～14天后,细胞重新分散为单个细胞(图1C)。经流式细胞仪鉴定CD3-CD56+细胞(图1D-I),外周血中占比较少的NK细胞(10.97%±3.28%),扩增到占比(83.20%±8.54%),细胞总数扩增倍数为(251.66±19.05)倍,NK细胞扩增倍数为(1 940.17±402.22)倍。

图1 NK细胞的培养结果

2.2 效应细胞对结直肠癌细胞系Caco-2的杀伤效果

NK细胞效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1组对靶细胞Caco-2杀伤效率显著高于其它效靶比组(P<0.05);PD-1单抗+NK细胞效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1组对靶细胞Caco-2杀伤效率显著高于其它效靶比组(P<0.05);效靶比2:1时NK细胞组与PD-1单抗+NK细胞组对靶细胞Caco-2的杀伤效率存在统计学差异(P<0.05)(表1,图2A)。

表1 NK细胞及PD-1单抗+NK细胞对靶细胞Caco-2的杀伤效率(%)

图2 NK细胞、PD-1单抗+NK细胞对靶细胞LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115、HRT-18在不同效靶比时的杀伤效率(%)

2.3 效应细胞对结直肠癌细胞系LOVO的杀伤效果

NK细胞对靶细胞LOVO在效靶比为1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和15∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);PD-1单抗+NK细胞对靶细胞LOVO在效靶比为2∶1、5∶1、10∶1和15∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);NK细胞组与PD-1单抗+NK细胞组对靶细胞LOVO的杀伤效率,在各个效靶比中差异均无统计学意义(P>0.05)(表2,图2A),此结果表明PD-1单抗的加入并不能提高NK细胞对结直肠癌细胞系LOVO的杀伤效率。

表2 NK细胞及PD-1单抗+NK细胞对靶细胞LOVO的杀伤效率(%)

2.4 效应细胞对结直肠癌细胞系HT-29的杀伤效果

NK细胞对靶细胞HT-29在效靶比为5∶1、10∶1、15∶1和20∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);PD-1单抗+NK细胞对靶细胞HT-29在效靶比为5∶1、10∶1、15∶1和20∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);效靶比5∶1和10∶1时NK细胞组与PD-1单抗+NK细胞组对靶细胞HT-29的杀伤效率,存在统计学差异(P<0.05)(表3,图2A)。

表3 NK细胞及PD-1单抗+NK细胞对靶细胞HT-29的杀伤效率(%)

2.5 效应细胞对结直肠癌细胞系HT-115的杀伤效果

从结果可以看出(表4,图2A),效应细胞和效靶比的交互作用对因变量杀伤效率的影响存在统计学差异(F=4.366,P=0.002),即效应细胞不同对杀伤效率的影响在不同效靶比之间存在差异。NK细胞对靶细胞HT-115在效靶比为2∶1、5∶1和10∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);PD-1单抗+NK细胞对靶细胞HT-115在效靶比为2∶1、5∶1和10∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);在效靶比为0.1∶1、0.5∶1时NK细胞组与PD-1单抗+NK细胞组对靶细胞HT-115的杀伤效率,存在统计学差异(P<0.05)。

表4 NK细胞及PD-1单抗+NK细胞对靶细胞HT-115的杀伤效率(%)

2.6 效应细胞对结直肠癌细胞系HRT-18的杀伤效果

NK细胞对靶细胞HRT-18在效靶比为0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1和5∶1时杀伤率显著高于其它效靶比组(P<0.05);PD-1单抗+NK细胞对靶细胞HRT-18在其它效靶比时显著高于15∶1和20∶1的实验组(P<0.05);NK细胞组与PD-1单抗+NK细胞组对靶细胞HRT-18的杀伤效率,在各个效靶比中差异均无统计学意义(P>0.05)(表5,图2A),此结果表明PD-1单抗的加入并不能提高NK细胞对结直肠癌细胞系HRT-18的杀伤效率。

表5 NK细胞及PD-1单抗+NK细胞对靶细胞HRT-18的杀伤效率(%)

2.7 NK细胞对结直肠癌细胞系杀伤效果的比较

由于PD-1单抗并不能增加NK细胞对结直肠癌细胞系的杀伤效果,因此只比较了NK细胞对不同结直肠癌细胞系最高杀伤效率的差异性以及效靶比之间的差异性。从结果可以看出(图2B),NK细胞对LOVO、HT-29的杀伤效率与Caco-2、HT-115的杀伤效率相比差异显著(P<0.05),与HRT-18的杀伤效率相比差异极显著(P<0.01)。不同细胞系最高杀伤效率的效靶比结果显示,LOVO以及HT-29均为10∶1,Caco-2为0.1∶1,HT-115为2∶1,HRT-18为1∶1。每种杀伤效率最高的效靶比都有与其无统计学意义的效靶比组,通过统计结果表明,五种靶细胞均在效靶比为2∶1时有一个好的杀伤结果,而后随着效靶比的增高有三种靶细胞(Caco-2、TH-115、HRT-18)的杀伤效率降低明显。

3 讨论

免疫检查点是指在免疫细胞上表达的一系列分子,它能调节免疫细胞的激活,是人体维持免疫稳态的重要调控机制。PD-1发挥作用是在免疫应答的后期,通过影响干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因α(TNF-α)以及白细胞介素2(IL-2)等细胞因子的分泌进而影响T细胞的增值。目前,在我国已经上市的PD-1抑制剂帕博利珠单抗适用于各种类型的高突变负荷的错配修复缺失MSI型肿瘤,但对微卫星稳定MSS型结直肠癌患者不起作用[11]。然而对于结直肠癌患者,MSS型占绝大多数,如何提高PD-1抑制剂对这部分患者的治疗效果十分具有探讨研究价值。

NK细胞参与天然免疫和适应性免疫,是先天免疫系统中最具杀伤性的细胞毒性淋巴细胞,能够介导强大的抗病毒和抗肿瘤作用[12]。同时还具有强大的间接增强T细胞免疫应答的作用,是T细胞发挥抗肿瘤功能的基础[13]。有研究表明,NK细胞受损和细胞数量的减少,与各类肿瘤的进展都具有相关性[14-15]。本研究通过细胞因子诱导扩增PBMCs的方法体外扩增培养NK细胞,将外周血中数量占比较少(10.97%±3.28%)的NK细胞扩增至占比(83.20%±8.54%),细胞总数扩增倍数为(251.66±19.05)倍,NK细胞扩增倍数为(1 940.17±402.22)倍。本研究结果说明,通过细胞因子诱导培养的方法可以大量扩增纯度较高的NK细胞,为NK细胞的临床应用奠定基础。

过继性免疫治疗是肿瘤免疫疗法的一种,其原理是将人体内的抗肿瘤免疫细胞采集后,经过体外培养扩增后回输患者,以增强人体免疫系统,从而达到抗肿瘤的目的。本研究结果显示,当达到最佳杀伤效率的效靶比后,随着效靶比的增加,NK细胞对结直肠癌细胞系的杀伤效率反而降低,此结果提示应用NK细胞过继回输治疗结直肠癌时,并不是NK细胞越多越好,将效靶比控制在2∶1时可能是一个安全且治疗效果最好的比例。

许多研究结果都说明NK细胞在PD-1信号通路阻断疗法中发挥着十分重要的作用。本研究结果表明,PD-1单抗与NK细胞联合应用对Caco-2(效靶比2∶1)、HT-29(效靶比5∶1和10∶1)以及HT-115(效靶比0.1∶1和0.5∶1)细胞系的杀伤效率与单独NK细胞相比差异显著(P<0.05),其余各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。提示PD-1单抗可以联合NK细胞过继性回输治疗结直肠癌且有一定的治疗意义。

LOVO细胞系是人源高转移的晚期结肠癌细胞系(来源于左锁骨上区转移灶,TNM Ⅳ期),HT-115细胞系来源于人的肺转移病灶,两种细胞系均属于恶性程度较高的未分化细胞系,具有较强的侵袭和迁移能力。HT-29细胞系来源于中等程度分化的腺癌(人结肠原发灶,TNMⅠ期),恶性程度较低,侵袭和迁移能力较弱。HRT-18细胞系又名HCT-8,是人源的回盲部结直肠腺癌(结肠癌原发灶);Caco-2细胞系来源于人结肠腺癌,常被用于体外肠上皮屏障模型;这两种细胞系均属于高分化的结直肠癌细胞系。从结果可以看出,NK细胞对未分化细胞系LOVO以及中分化细胞系HT-29的杀伤效率最高,在效靶比为10∶1时,几乎可以达到100%的杀伤效果;对于未分化细胞系HT-115以及高分化细胞系Caco-2的杀伤效率在较低效靶比时(分别是0.1∶1和2∶1)也能达到70%以上的杀伤效果;然而对于恶性程度很低的高分化细胞系HRT-18,NK细胞对其最高杀伤效率仅能达到38.78%±8.94%,这些结果表明NK细胞对结直肠癌的杀伤效率与其分化程度无关。除HRT-18细胞系外,NK细胞对其余四种细胞系的最高杀伤效率都达到了70%以上,提示NK细胞对大多数结直肠癌的杀伤效果较好,NK细胞过继性回输适用于结直肠癌的治疗。本研究结果还提示了HRT-18结直肠癌细胞系的特殊性,因此需要后续进行深入研究探索其作用机制。

本研究通过CCK-8法检测NK细胞及PD-1单抗+NK细胞杀伤五种结直肠癌细胞系LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115、HRT-18的效率及最佳效靶比,通过统计比较两种效应组对结直肠癌细胞系的杀伤效果。结果表明PD-1单抗与NK细胞联合应用对结直肠癌有一定的治疗意义,将效靶比控制在2∶1时可能是一个安全且治疗效果最好的比例。本研究的结果为肿瘤免疫逃逸的研究提供了可作为目标的研究细胞以及研究方向,为应用NK细胞过继性回输治疗结直肠癌的临床应用奠定了基础。目前,科学家认为肿瘤免疫治疗是攻克人类肿瘤难题的一个极有希望的治疗方法,对肿瘤免疫的深入研究将为攻克人类癌症提供新的方向。