HPLC 法测定N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中杂质含量

李焕君，王晓凤，王莉莉，康 倩，张晓灿，刘晓莲，马宁宁

（河北冀衡药业股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

叶酸是一种广泛存在于绿色蔬菜水果中的B族维生素。叶酸是多数生物体内碳单位的供体，是氨基酸、核酸及泛酸等生物合成所必需的物质。人体特别是孕妇体内缺乏叶酸则会引起氨基酸合成减少进而引发严重的疾病，例如婴儿的巨幼细胞性贫血、神经管缺陷、心血管疾病等症。动物体内缺少叶酸时，则发生食欲减退，生长受阻，羽毛发育不良等。

N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸是以对硝基苯甲酸为起始原料，先经酰氯化反应制得对硝基苯甲酰氯，然后与谷氨酸钠经缩合反应制得N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸，最后经还原反应制得N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸。N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸和2,4,5-三氨基-6- 羟基嘧啶、三氯丙酮生成叶酸粗品，叶酸粗品经过二次酸溶、碱溶得到叶酸湿成品，最后对湿成品进行干燥、混合、包装。

N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸是合成叶酸的重要中间体，作为河北冀衡药业股份有限公司生产叶酸的主要原料对该产品的质量要求较高，对硝基苯甲酸、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸杂质含量过高会直接影响N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的质量，在生产过程中也会传递到叶酸产品中，将会影响叶酸安全性和有效性，因此需要控制该产品的杂质含量，来提高叶酸产品的质量。本方法的建立能够更好地控制原料药叶酸使用的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的质量。

1 实验部分

1.1 实验用分析仪器及试剂

主要实验仪器：分析天平（赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司，型号QUINIX124-1CN），高效液相色谱仪（Waters Arc-2489），Milli-Q IQ 7000超纯水仪（德国默克密理博），KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

主要试剂：甲醇（色谱纯），厂家：默克；N-对氨基苯甲酰-L- 谷氨酸标准品：EDQM 法定标准品；对氨基苯甲酸、对硝基苯甲酸、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸对照品：中国食品药品检验研究院。

1.2 色谱条件

色谱柱：十八辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱（AcclaimTM120 C18，5 μm 150 mm×4.6 mm）；流动相：磷酸盐缓冲液∶甲醇=80∶20；检测波长：245 nm；进样量：20 μL；流速：1.2 mL/min；柱温：40 ℃。

2 结 果

2.1 方法的专属性研究

2.1.1 溶液配制

（1） 对氨基苯甲酸溶液：称取对氨基苯甲酸约10 mg 于100 mL 容量瓶中，加入5 mL 28.6 g/L碳酸钠溶解，加流动相稀释至刻度。

（2） 对硝基苯甲酸溶液：称取对硝基苯甲酸约10 mg 于100 mL 容量瓶，加入5 mL 28.6 g/L 碳酸钠溶解，加流动相稀释至刻度。

（3） N- 对硝基苯甲酰-L- 谷氨酸溶液：称取N- 对硝基苯甲酰-L- 谷氨约10 mg 于100 mL容量瓶中，加入5 mL 28.6 g/L 碳酸钠溶解，加流动相稀释至刻度。

（4） N- 对氨基苯甲酰-L- 谷氨酸溶液（氨一）：称取（氨一） 对照品约10 mg 于50 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 28.6 g/L 碳酸钠溶解，加流动相稀释至刻度。

2.1.2 操作步骤

氨一与各杂质的混合溶液：称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸（氨一） 对照品约10 mg 于50 mL容量瓶中，加入2.5 mL28.6 g/L 碳酸钠溶解，加入对氨基苯甲酸溶液、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸溶液、对硝基苯甲酸溶液，加流动相稀释至刻度。分别精密上述溶液各20 μL 注入液相色谱仪。

2.1.3 方法专属性结果

方法专属性结果见表1。

表1 方法专属性结果Table 1 Methods exclusivity results

由表1 可得，混合溶液中与N-对氨基苯甲酰-L- 谷氨酸主峰相邻的杂质峰的分离度分别为2.72、4.82，均＞1.5，符合规定，各杂质分离效果良好。

N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸与各杂质对照品的分离度图谱如图1 所示。

图1 N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸与各杂质对照品的分离度图谱Fig.1 Resolution profile of N-p-aminobenzoyl-L-glutamate from each impurity control

2.2 方法的线性

2.2.1 对氨基苯甲酸的线性及范围

精密称取对氨基苯甲酸标准品适量，加样品稀释剂溶解并稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL 的6 个不同浓度的对氨基苯甲酸标准品溶液，并依次编号。取上述各浓度的溶液20 μL，按照“2.1”项下的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图并计算峰面积。得出的数据以峰面积为纵坐标，以对氨基苯甲酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

对氨基苯甲酸的线性关系标准曲线如图2所示。

图2 对氨基苯甲酸的线性关系Fig.2 Linear relationship of aminbenzoic acid

由图2 可得，在0.010 09 ～0.605 4 μg/mL 的线性范围内，具有良好的线性关系，相关系数R2=0.999 5，线性方程为：y=282 95x+12.835。

2.2.2 对硝基苯甲酸的线性及范围

精密称取对硝基苯甲酸标准品适量，加样品稀释剂溶解并稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL 的6 个不同浓度的对硝基苯甲酸标准品溶液，并依次编号。取上述各浓度的溶液20 μL，按照“2.1”项下的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图并计算峰面积。得出的数据以峰面积为纵坐标，以对硝基苯甲酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

对硝基苯甲酸的线性关系的标准曲线如图3所示。

图3 对硝基苯甲酸的线性关系Fig.3 Linear relationship for pair-nitrobenzoic acid

由图3 可得，在0.025 ～0.600 0 μg/mL 的线性范围内，具有良好的线性关系，相关系数R2=0.998 1，线性方程为：y=21 361x+182.01。

2.2.3 N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸的线性及范围

在N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸定量限浓度至限度的150%范围内，精密称取N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸标准品适量，加样品稀释剂溶解并稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL 的6个不同浓度的N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸标准品溶液，并依次编号。取上述各浓度的溶液20 μL，按照“2.1”项下的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图并计算峰面积。得出的数据以峰面积为纵坐标，以N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸的线性关系标准曲线如图4 所示。

图4 N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸的线性关系Fig.4 N-Lineity of p-nitrobenzoyl-L-glutamate

由图4 可得，在0.027 027 ～0.600 6 μg/mL 的线性范围内，具有良好的线性关系，相关系数R2=0.999 7，线性方程为：y=12 578x-77.804。

2.3 加标精密度的测定

2.3.1 供试品溶液

精密度称取同一批次6 份N- 对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品各10.0 mg 分别于不同的50 mL 容量瓶中，加入2.5 mL28.6 g/L 碳酸钠溶解，加入定量限浓度的对硝基苯甲酸、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸以流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.3.2 系统适用性试验溶液

精密称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸对照品10 mg、对氨基苯甲酸对照品10 mg 至同一个50 mL容量瓶中，加入5.0 mL28.6 g/L 碳酸钠溶解，流动相稀释至刻度，摇匀。再精密吸取2.5 ～10 mL 容量瓶中，流动相定容，摇匀。

2.3.3 测定

分别吸取溶剂、系统适用性溶液、样品溶液各20 μL 注入液相色谱仪，运行时间为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸主峰保留时间的5 倍。杂质对氨基苯甲酸的检测数据分别为0.19%、0.19%、0.20%、0.19%、0.20%、0.18%，计算RSD 为3.93%；杂质对硝基苯甲酸的检测数据为0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%，计算RSD为0；杂质N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸的检测数据为0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%，计算RSD 为0，6 份样品溶液重复性较好，方法的精密度较高。

2.4 样品溶液的检测

2.4.1 供试品溶液

分别称取3 批样品10 mg 于不同的50 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 28.6 g/L 碳酸钠溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.4.2 测定

分别吸取溶剂、系统适用性、供试品溶液各20 μL 注入液相色谱仪，运行时间为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸主峰保留时间的5 倍。

不同批次样品对氨基苯甲酸的检测结果为0.05%、0.06%、0.05%，对硝基苯甲酸、N- 对硝基苯甲酰-L-谷氨酸杂质均未检出，得到的样品峰形较好，样品溶液杂质浓度在线性范围内。该方法适于N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中对氨基苯甲酸、对硝基苯甲酸、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸杂质的检测。

3 结 语

本文所建立的液相色谱法定量分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中对氨基苯甲酸、对硝基苯甲酸、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸杂质，具有操作简单，耗时小，误差小等优点，结果表明，N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸与对氨基苯甲酸分离度为4.82，对氨基苯甲酸在浓度0.010 09 ～0.605 4 μg/mL 具有良好的线性，r=0.999 7，线性方程：y=28 295x+12.835；对硝基苯甲酸在浓度0.025 ～0.600 0 μg/mL 具有良好的线性，r=0.999 0，线性方程：y=21 361x+182.01；N- 对硝基苯甲酰-L- 谷氨酸在浓度0.027 027 ～0.600 6 μg/mL 具有良好的线性，r=0.999 8， 线性方程：y= 12 578x-77.804，样品溶液杂质浓度在线性范围内，6 个样品的重复性较好，因而该方法可以作为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中，对氨基苯甲酸、对硝基苯甲酸、N-对硝基苯甲酰-L-谷氨酸杂质的定量检测。