入侵植物肿柄菊不同组织提取液对千金子的化感作用

王占娣　赵静　陈绍娟　徐荣　史云东　贾琳　李艳萍

关键词：肿柄菊；千金子；化感作用；抗氧化酶

中图分类号：S432.1 文献标识码：A

外来入侵植物严重破坏了入侵地生态和生物多样性，给全球生态系统造成了巨大的经济损失。现代研究发现，化感作用是入侵植物成为优势群落的主要因素之一[1]，对自身或其他植物生长发育产生一定的影响。化感物质为植物释放到土壤和环境中的次生代谢产物，能够对其他植物产生毒害作用，抑制周围植物种子的萌发和幼苗的生长[2]。如龙绛雪等[3]报道入侵植物鬼针草（Bidenspilosa）和肿柄菊（Tithonia diversifolia）水提液抑制小白菜种子的萌发。杨云海等[4]报道紫茎泽兰（Ageratina adenophora）提取液明显抑制小麦和绿豆的生长。许多研究者还发现，入侵植物释放的化感物质除了对农作物有抑制作用外，对杂草的生长也有抑制作用。如蒋智林等[5]报道入侵植物紫茎泽兰（Ageratina adenophora）、小飞蓬（ Conyza canadensis ）、飞机草（ Chromolaenaodoratum）和肿柄菊对狗牙根（Cynodon dactylon）具有明显抑制作用。陈金慧等[6]报道入侵植物五爪金龙能明显抑制三叶草种子的萌发。由此可知，入侵植物释放的化感物质可用于杂草的防治。化感物质具有环境友好，低毒高效、不易产生抗药性等特点，利用化感物质防治杂草危害已成为当前农业杂草绿色防治和生态领域研究的热点之一[7]。

肿柄菊是一种世界性入侵杂草，为菊科多年生灌木类植物，其根系发达，繁殖力强，能在各类土壤上生长。肿柄菊原产墨西哥及中美洲地区，是一种观赏植物，后被亚洲、非洲、北美、澳洲等70 多个国家和地区广泛引种。20 世纪初，肿柄菊被引入我国后迅速在云南、广东、福建、海南、香港、台湾等地大量分布和扩散。现已覆盖云南省12 个市（州），71 个县（区），扩散面积达184.212 km2，占云南土地面积的47%[8]。2019年肿柄菊被列为云南省Ⅰ级恶性入侵杂草。2021年陈剑等[9]报道，肿柄菊在云南还存在较大的入侵风险。CHUKWUKA 等[10]报道因肿柄菊繁殖速度快、生长迅速、植株高度等原因，迫使尼日利亚部分农民放弃耕地。现代研究发现，肿柄菊具有较强的化感作用，其释放的化感物质对其他植物产生毒害作用，抑制多种植物种子的萌发和幼苗的生长。到目前为止，发现肿柄菊对田间10 余种杂草具有较强的化感作用[5， 11-12]，如田学军等[13]报道肿柄菊叶片的蒸馏水提取液能抑制鬼针草种子的萌发和幼苗的生长，SUZUKI 等[14]报道肿柄菊的甲醇提取液抑制多花黑麦草（Lolium multiflorumLam.）、Phleum pretense （L.）和Echinochloacrusgalli （L.）雜草的生长，而未见有文献报道肿柄菊对千金子的化感作用。

千金子[Leptochloa chinensis （L） Nees]为一年生禾本科杂草，是世界性水田中常见的恶性杂草，可导致水稻产量降低37.8%～39.22%[15-16]。目前千金子的防治以农药防治为主，由于化学农药的长期使用，造成千金子对化学农药产生了很强的抗药性[17]，而且许多化学农药严重污染水体、大气、土壤等，并通过食物链进入人体危害人类健康。因此寻找千金子的生态绿色防治技术越来越受到社会各界的重视。

本研究以肿柄菊为供体植物，以千金子为受体植物，采用不同极性溶剂提取肿柄菊，研究肿柄菊提取液对千金子种子萌发和生长的影响，并采用GC-MS 鉴定肿柄菊提取液中化学成分，为千金子的绿色防治奠定理论基础，同时为肿柄菊化感物质在杂草防治方面的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

肿柄菊和千金子采集于玉溪师范学院校园内（23°19′N；101°16′E），海拔约为1800 m，年平均气温为17.4～23.8℃，年平均降水量为670～2412 mm，属中亚热带湿润冷冬高原季风气候。选取颗粒饱满的千金子种子，将其放在蒸馏水中浸泡，收集沉降在水底的种子，用0.2%高锰酸钾溶液浸泡10 min 消毒，之后用蒸馏水冲洗5 次，备用。

1.2 方法

1.2.1 肿柄菊提取液的制备 采集到的肿柄菊根、茎、叶自然晾干，粉碎过20 目筛，分别准确称取15 g，利用索氏提取器，根据溶剂极性由小到大依次加入100 mL 石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇和蒸馏水，加热提取，提取温度分别为：80℃（石油醚）、85℃（乙酸乙酯）、85℃（无水乙醇）、100℃（蒸馏水）。待索氏提取器侧管内溶液色泽变淡，收集各溶剂提取液。采用旋转蒸发仪浓缩，干燥，得到干膏。

称取1 g 干膏，加入0.5 mL 吐温-80（蒸馏水提取液制备的干膏除外）混合均匀，加入蒸馏水分别稀释10 倍和100 倍，备用。

1.2.2 肿柄菊提取液的鉴定 采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）鉴定肿柄菊提取液中化学成分。检测条件为GC：进样量1.0 μL；分流比20∶1；进样温度250℃；程序升温：初始温度40℃，保持2 min；以5℃/min 升温至260℃，保持10 min。MS：传输线温度250℃；离子源温度250℃；扫描线：Tic（全扫描）；柱子：Ei 比–5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；离子源70 eV；扫描时间和GC 时间一致，扫描范围33～550 m/z。

1.2.3 千金子发芽及生长效应实验 采用培养皿滤纸培养法[6]。将灭菌的千金子种子放于已灭菌且铺有双层滤纸的培养皿中，分别加入10 mL 稀释10 倍和100 倍的提取液，以加入等量的吐温–80水溶液的培养皿为对照。每个处理3 次重复，每个重复50 粒种子。在25℃，光照条件为L∶D=12 h∶12 h 下培养，每天定时补充等量的提取液，直至对照组不再萌发，测定其发芽率。发芽后7 d 测定各处理组幼苗株高、根长和地上部分鲜重。

1.2.4 酶活性实验 酶粗提液的制备： 参照DHINDSA[17]的方法，称取0.5 g 培养15 d 幼苗根上部位，加入3 mL 磷酸缓冲液（pH 7.0）和少许石英砂，冰浴中研磨匀浆，于4℃，3000 r/min，离心10 min，取上清液，备用。

SOD 酶活性测定：采用核黄素-NBT 法测定[17]，试管中加入1.5 mL 50 mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8 ）、13.0 mL 14.5 mmol/L 蛋氨酸、0.1 mL2.25 mmol/L NBT、0.1 mL 3 μmol/L EDTA-Na2、0.1 mL 22.6 mmol/L 核黄素和50 μL 酶粗提液，光照下反应20 min，560 nm 处测定吸光度。

CAT 活性的测定：采用紫外吸收法测定[18]，试管中加入50 μL 酶粗提液、2.9 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），25℃水浴中预热5 min 后加入50 μL H₂O₂启动反应，240 nm处测定吸光度。CAT 活性计算公式如下：

式中，ΔA₂₄₀为240 nm 波长处的吸光度；ε为H₂O₂在240 nm 处的毫摩尔吸光系数，即42l mmoL/cm；T 为酶促反应时间，即3 min；V_t为反应液的总体积，即3 mL；V₁为酶液的总体积，即5 mL；V₂为测定时所用酶液的体积，即0.05 mL；ω 为杂草的鲜重，g。

POD 活性测定：采用愈创木酚法[18]。吸取备用液（100 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液、5 mL 愈创木酚和1 mL 30%H₂O₂）3 mL 于试管中，加入酶提取液0.02 mL，迅速摇匀后倒入1 cm 的比色皿中，以未加酶提取液的备用液作为空白对照，470 nm 波长处，测定3 min 内吸光度变化值，取线性变化部分，计算1 min 吸光度变化值（ΔA₄₇₀）。

POD 酶活性计算公式为：POD 酶活性[μg/（g·min）]=ΔA₄₇₀×Ｖ１V1/（ωV2）式中，ΔA₄₇₀为1 min 吸光度变化值；V₁为酶提取液总量，mL；V₂为测定时酶液用量，mL；ω 为样品鲜重，g。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准误表示，利用SAS9.4 软件单因素方程进行数据处理（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 肿柄菊提取液对千金子种子萌发的影响

肿柄菊根、茎和叶的乙酸乙酯和无水乙醇提取液均能明显抑制千金子种子萌发。3 个部位提取液对千金子发芽率的抑制效果依次为叶>茎>根，其中肿柄菊的无水乙醇提取液抑制效果最为明显。肿柄菊叶的无水乙醇提取物稀释倍数为10倍时，其处理的千金子发芽率为0（图1）。

2.2 肿柄菊提取液对千金子生长的影响

2.2.1 对千金子鲜重的影响 肿柄菊提取液对千金子鲜重具有明显的抑制作用，其抑制强度由大到小依次为：肿柄菊无水乙醇提取液>肿柄菊石油醚提取液≈肿柄菊乙酸乙酯提取液>肿柄菊蒸馏水提取液。随着给药浓度稀释倍数的增加，肿柄菊不同溶剂提取液对千金子鲜重的抑制作用降低。提取液稀释10 倍时，肿柄菊根、茎和叶的石油醚、乙酸乙酯和无水乙醇提取液处理的千金子鲜重明显低于CK 处理组，其中，肿柄菊叶的不同溶剂提取物对千金子鲜重的抑制作用最为明显（图2）。

2.2.2 对千金子株高和根长的影响 提取液稀释10 倍时，肿柄菊根、茎、叶的乙酸乙酯和无水乙醇提取液均能明显抑制千金子的根长和株高的生长（图3，图4）。肿柄菊不同组织的蒸馏水提取液对千金子根长和株高作用效果存在差异。其中，肿柄菊根的蒸馏水提取液促进千金子株高和根长的生长，茎的蒸馏水提取液抑制千金子株高和根长的生长，叶的蒸馏水提取液对千金子株高和根长的影响与CK 差异不显著。提取液稀释100 倍时，根的蒸馏水提取液促进千金子株高和根长的生长，根的石油醚提取液和乙酸乙酯提取液抑制千金子株高的生长，而对根长作用不明显；茎的蒸馏水提取液、乙酸乙酯提取液和无水乙醇提取液明显抑制千金子根长和株高的生长，茎的石油醚提取液对千金子根长和株高作用不明显；叶的乙酸乙酯提取液明显抑制千金子株高的生长，叶的石油醚提取液和无水乙醇提取液明显抑制千金子根长的生长。

2.3 肿柄菊提取液对千金子酶活性的影响

根据上述实验结果，肿柄菊根、茎和叶的乙酸乙酯和无水乙醇提取液对千金子发芽率和生长效应影响较明显，因此，进一步测定肿柄菊根、茎和叶的乙酸乙酯提取液和无水乙醇提取液对千金子CAT、POD 和SOD 酶的作用。结果显示：肿柄菊不同组织提取液对3 种酶的作用存在明显差异，其中，肿柄菊根、茎和叶的乙酸乙酯提取液，叶和根的无水乙醇提取液能明显抑制千金子SOD 酶活性，而茎的无水乙醇提取液促进SOD酶活性（图5A）。肿柄菊茎的无水乙醇提取液能明显抑制千金子CAT 酶的活性，根的乙酸乙酯提取液促进千金子CAT 酶的活性，其他处理液对千金子CAT 酶活性的作用与CK 差异不显著（图5B）。肿柄菊茎的无水乙醇提取液和叶的乙酸乙酯提取液明显促进POD 酶的活性，而根的乙酸乙酯提取液能明显抑制POD 酶活性（图5C）。

2.4 肿柄菊提取液的化合物鉴定

结合发芽实验、生长效应实验和酶活实验结果，采用GC-MS 鉴定肿柄菊茎和叶的无水乙醇提取液和乙酸乙酯提取液的化学成分。结果显示，肿柄菊茎的乙酸乙酯提取液中含有萜类（1、2）、内酯类（3）和酚类（4），其中，α-蒎烯含量最高，为4.828%。肿柄菊茎的无水乙醇提取液中包括8种化合物，分別为酚类（1、7）、酮类（2）、酰胺类（3）、酯类（4、8）、烃类（5、6）。其中，酚类成分中的2，5-二乙酰基-6-羟基苯并呋喃含量最高，为10.79%。肿柄菊叶的乙酸乙酯提取液中含有8 种化学成分，主要为萜类（1、3、8）、酯类（2、4、5、6、7），其含量最高的为萜类成分，即植醇，其含量为14.68%。肿柄菊叶的无水乙醇提取液中含有酯类（3、5、6、7）、烃类（1、2）、萜类（4、8）、酚类（9）、萘醌类（10），其中，萜类成分含量较高。在萜类成分中，二十碳炔含量最高，其值为20.614%，其次为植醇，其含量为7.994%（表1）。

3 讨论

化感作用是外来入侵植物成为优势群落的主要因素之一[6]。植物的叶、果实、茎和根是植物释放化感物质的主要部位，其通过淋溶、凋零物、挥发和根系分泌物等方式释放化感物质[19]。这些化感物质通过作用于植物种子和幼苗，影响周围植物物种的分布[20]。如蒋智林等[21]报道紫茎泽兰、小飞蓬、飞机草和肿柄菊等4 种植物叶的水提液能明显抑制狗牙根种子萌发。梁晓华等[22]报道，肿柄菊的根、茎和叶水提液能明显抑制玉米、水稻、油菜、豌豆、绿豆的发芽及生长。王丽等[11]报道肿柄菊茎叶水提液能明显抑制水田稗草种子萌发和幼苗生长。本研究发现，肿柄菊根、茎和叶的无水乙醇提取液和乙酸乙酯提取液对千金子种子的萌发和幼苗生长具有明显的抑制作用。这与MIRANDA 等[23]报道的肿柄菊不同组织对禾本科杂草稗草（Echinochloa crusgalli L.）和臂形草[Urochloa decumbens （Stapf） R.D. Webster]的研究结果相同。

植物在遭受外界干旱、水淹、冷冻和农药胁迫等逆境时，其体内积累过量的过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O^2–）和羟自由基（-OH）等活性氧成分（ROS），ROS 积累过多会对植物产生严重伤害，导致细胞膜脂过氧化，加速植物的衰老，甚至死亡[24-25]。通过酶促系统清除，可延缓植物衰老[26]。超氧化歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）是植物抗氧化系统中的主要酶，这3 种酶通过协同作用维持植物体内的自由基含量，使其保持稳态水平，防止由于自由基引起的植物生理生化上的改变。其中，SOD 是生物体内清除自由基的首要物质，其将O^2-歧化H₂O₂和O₂，可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞[27]。CAT 将剩余H₂O₂催化为H₂O 和O₂[26]。POD 是酚类化合物的重要氧化酶，在有酚类化合物聚合成木质素的过程中具有重要作用，使细胞壁增厚，提高组织的抗胁迫能力[28]。如左应萍等[29]报道蛇床子微乳剂、氟吡菌酰胺悬浮剂和腈菌唑乳油可以提高烟草SOD 和CAT 酶活性，防治烟草白粉病。张瑜瑜等[30]报道，外源水杨酸处理采摘后的蓝莓能提高SOD 和POD 酶活性，減缓自由基的含量，增加蓝莓保质期。本研究表明，肿柄菊的根、叶的无水乙醇和乙酸乙酯提取液能降低SOD 酶活性，茎的乙酸乙酯提取液和无水乙醇提取液降低SOD酶和CAT 酶活性，根的乙酸乙酯提取液能降低POD 酶活性。因此，千金子细胞清除肿柄菊根、茎和叶提取液所产生的自由基的能力降低，导致幼苗生长受到抑制，是肿柄菊提取液对千金子产生防治效果的重要因素。

植物次生代谢物质是植物发挥化感作用的主要成分，现代研究发现，具有化感作用的物质有10 多万种，包括萜类、酚类、糖和糖苷类、生物碱和非蛋白质氨基酸类等14 种，其中酚类、萜类和低分子的有机酸是最为常见的化感物质[2]。2015 年，MIRANDA 等[23]报道肿柄菊根、茎、叶的乙酸乙酯提取液中的倍半萜内酯类成分1β-methoxydiversifolin， tagitinin A 和tagitinin C 是肿柄菊抑制稗草和臂形草生长的活性成分。本研究采用GC-MS 分析肿柄菊茎、叶的乙酸乙酯和无水乙醇提取液中化合物发现，肿柄菊提取液中含有萜类、酚类、酰胺类、酯类及烃类。其中，萜类和酚类成分含量较高。萜类成分主要为α-蒎烯和植醇，酚类成分主要为2，5-二乙酰基-6-羟基苯并呋喃和维生素E。陈金慧等[6]报道α-蒎烯是五爪金龙对三叶鬼针草产生化感作用的活性成分之一。AL-ROWAILY 等[31]报道来自沙特阿拉伯和印度的鹿角菊（Calotropis procera）释放的挥发油能抑制鬼针草（Bidens ilosa）的生长，其挥发油均以萜类成分为主，在这些萜类中均含有植醇。李春英等[32]报道茼麻挥发油中的萜类成分对小麦、玉米和大豆的萌发具有较强的抑制作用，其中植醇在茼麻萜类中含量最高。由此推知，植醇可能对植物生长具有一定的化感作用。维生素E是植物自我修复的主要成分，其能清除脂质过氧化产生的自由基，对植物具有保护作用[33]。由此推测，肿柄菊中的萜类成分（α-蒎烯和植醇）和酚类成分（2，5-二乙酰基-6-羟基苯并呋喃）是肿柄菊对千金子产生化感作用的活性成分，对此还需进一步验证。