不同水培条件对绞股蓝生长及总皂苷含量的影响

李莹　黄雪彦　余丽莹　姚李祥　周芸伊　王春丽　蓝祖栽　张占江　潘春柳

关键词：绞股蓝；水培条件；绞股蓝皂苷

中图分类号：S567.237 文献标识码：A

绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino] 为葫芦科（ Cucurbitaceae ） 绞股蓝属（Gynostemma）多年生草质攀援植物，主要分布于我国陕西南部和长江以南各省区[1]。绞股蓝应用历史悠久，是一种重要的药食同源植物。绞股蓝之名始载于明代《救荒本草》，被作为野菜食用。现代研究表明，绞股蓝具有益气健脾、补肾温阳、养心安神等功效[2]，其主要活性成分为绞股蓝皂苷[3]，此外还含有黄酮、多糖、氨基酸和微量元素等化学成分。因含有人参皂苷，绞股蓝被称为“南方人参”，并于1986 年被科技部“星火计划”列为待开发的第一位“名贵中药材”，于2002 年被卫生部纳入保健食品原料目录[4]。近年来绞股蓝作为重要的中药和保健品原料，被广泛应用于医药和保健领域，具有广阔的市场开发前景，其应用价值巨大。

由于野生绞股蓝资源日益枯竭，为了满足日益增长的市场需求，人工引种栽培绞股蓝已成为必然趋势。然而，由于土壤灌溉、施肥、农药使用等因素影响，绞股蓝药材品质不稳定、重金属含量超标等问题时有发生，严重影响其规范化种植和药材质量安全。水培作为无土栽培的一种方式，具有周期短、产量高、品质好、省地、省水、省肥、省工、病虫害少、无连作障碍等优点，并且可以有效避免重金属污染，有利于中药材有机种植[5]，被广泛应用于蒲公英[6]、益母草[7]、鱼腥草[8]、桔梗[9]、人参[10]等中药材生产中，已成为近年来中药材生产的重要技术手段之一。本研究以绞股蓝为试验材料，通过设置不同营养液、不同温度、不同光照强度和光周期条件开展绞股蓝水培对比实验，以筛选出适合绞股蓝生长和有效成分积累的最优水培方式，为绞股蓝规模化生产和有机种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

于2020 年10—11 月采集绞股蓝成熟果实，采集地为广西金秀县。植物材料经广西药用植物园余丽莹研究员鉴定。

1.2 方法

1.2.1 播种育苗 将果实置于阴凉通风处晾干，取出种子，以珍珠岩为基质进行播种育苗。育苗期间每天喷水1～2 次，以保证珍珠岩湿度。待幼苗长出后，选取3～5 叶期长势较好且生长一致的绞股蓝幼苗进行水培移栽。

1.2.2 营养液对比实验 将供试绞股蓝幼苗移植至清水中，缓苗2 d 后进行水培处理。温度条件为25 ℃，光照强度为20 μmol/（m²·s），光周期为每天8 h 光照/16 h 黑暗。分别选用不同pH 的4种水培营养液（改良Hoagland、日本山崎、日本园试和华南农业大学叶菜A）进行培养，使用HCl或NaOH 调整营养液pH。营养液配方见表1 和表2[11-12]。实验共设13 个处理，分别为：（1）CK：清水；（2）H₆：pH 6.0 的Hoagland 营养液；（3）H₇：pH 7.0 的Hoagland 营养液；（4）H₈：pH 8.0的Hoagland 营养液；（5）S₆：pH 6.0 的日本山崎营养液；（6）S₇：pH 7.0 的日本山崎营养液；（7）S₈：pH 8.0 的日本山崎营养液；（8）Y₆：pH 6.0的日本园试营养液；（9）Y₇：pH 7.0 的日本园试营养液；（10）Y₈：pH 8.0 的日本园试营养液；（11）A₆：pH 6.0 的华南农业大学叶菜A 营养液；（12）A7：pH 7.0 的华南农业大学叶菜A 营养液；（13）A₈：pH 8.0 的华南农业大学叶菜A 营养液。以清水为对照（CK），每处理3 个重复，每重复25 株。每天用通气泵进行通气，每7 d 更换一次营养液。处理30 d 后测定绞股蓝植株存活率、生长指标及理化指标。

1.2.3 光照对比实验 将供试绞股蓝幼苗移植到清水中，缓苗2 d 后移栽至上述最优营养液中进行培养。为明确绞股蓝幼苗对光照条件的要求进行不同光周期（每天8 h 光照/16 h 黑暗、10 h 光照/14 h 黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h黑暗）以及不同光强[弱光20 μmol/（m²·s）、中光100 μmol/（m²·s）、强光200 μmol/（m2·s）]条件下的对比实验。光周期实验中温度条件为25 ℃，光照强度为100 μmol/（m²·s）；光强实验中温度条件为25 ℃，光周期为每天12 h 光照/12 h 黑暗。每处理设置3 个重复，每重复25 株。每天用通气泵进行通气，每7 d 更换一次营养液。处理30 d 后进行绞股蓝生长指标及理化指标测定。

1.2.4 温度对比实验 将供试绞股蓝幼苗移植到清水中，缓苗2 d 后按照上述最优营养液和光照条件进行移栽，然后分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃共6 种不同温度条件下进行培养。每处理设置3 个重复，每重复25 株。每天用通气泵进行通气，每7 d 更换一次营养液。處理30 d 后进行绞股蓝生长指标及理化指标测定。

1.3 指标测定

1.3.1 成活率 观察记录不同营养液处理中叶片生长及植株成活情况，统计植株死亡率及叶片枯黄萎蔫率。

死亡率=处理30 d 后死亡的植株数/该处理的总植株数×100%

枯黄萎蔫率=处理30 d 后半数及以上叶片出现枯黄或萎蔫的植株数/该处理的总植株数×100%

1.3.2 生长指标 统计不同营养液处理、光照强度处理及温度处理的株高、茎粗、叶长、叶宽、根长、叶片数。在每个处理中随机选取10株长势均一的植株，将根系表面水分充分吸干，测定植株鲜重。将植株放入80 ℃烘箱中烘干至恒重，测定植株干重。

1.3.3 理化指标 根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法进行测定[13]。用复合酶提取法测定总皂苷含量[14]。每处理3 个重复。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2013 软件对数据进行整理，使用IBM SPSS Statistics 22.0 软件对数据进行统计分析。利用SPSS 软件中的ANOVA 方法进行方差分析，采用Duncans 法进行显著性检验（检验水平为0.05）。结果表示为平均值±标准误（SE）。

2 结果与分析

2.1 不同营养液对绞股蓝生长及总皂苷积累的影响

2.1.1 不同营养液对幼苗生长指标的影响 从表3 可以看出，不同营养液条件下绞股蓝的成活情况存在明显的差异。水培30 d 后，以S₇、Y₆和A₇营养液培养的绞股蓝植株长势较好，培养后无死亡和叶片枯黄萎蔫现象。其次是H₇、S₈、A₆和A₈营养液，培养后绞股蓝植株无死亡现象，仅部分植株的叶片有枯黄或萎蔫现象。而使用H₆、H₈、S₆、Y₇或Y₈营养液进行培养时，会导致绞股蓝植株死亡，其中H₈营养液培养后植株死亡株数最多，死亡率达24%；H₈和S₆ 培养后多个植株出现叶片枯黄或萎蔫。此外，营养液对绞股蓝茎的伸长有促进作用。清水对照组的株高最小，仅为3.99 cm。Y₆处理的绞股蓝平均株高最高，达22.03 cm，与其他处理相比有显著性差异。H₇、S₈、Y₇、A₆、A₇处理的绞股蓝株高较高，均在15 cm以上。H₆、H₈和S₆处理对绞股蓝株高影响不大，平均值均在5 cm 以下。营养液对绞股蓝茎的增粗也有促进作用。其中，H₆培养的绞股蓝平均茎粗最大，为1.98 mm；A₆营养液培养次之，H₇、S₇、Y₆、A₇处理后茎粗无显著性差异，且均显著高于对照；A₈和Y₈处理后茎粗最小，与对照相比无显著性差异。从根长上看，除H₈、Y₈外，其余营养液处理对绞股蓝根长生长均有显著的促进作用。其中A₇营养液处理的绞股蓝平均根长最长，为12.44 cm；A₆、A₈和S₈次之，均在9 cm 以上。由此可见，适当的营养液可促进绞股蓝植株生长。

由表4 可以看出，清水对照组的叶长和叶宽最小，分别为2.94 cm 和3.25 cm。使用不同营养液进行培养，除H₆、H₈和S₆之外，均可显著促进绞股蓝叶片生长。其中，A₇处理的绞股蓝叶片最长，平均值为4.98 cm；A₆和H₇ 次之。S₇处理的绞股蓝叶片最宽，平均值为6.35 cm；H₇和Y₇次之。不同营养液处理后叶片数也存在明显差异。Y₆和A₇营养液处理的水培绞股蓝叶片数最多，S₈和Y₇次之。H₆、H₈和S₆处理的叶片数最少，且均低于对照，表明这3 种培养液不利于绞股蓝叶片分化。

由表5 可以看出，与对照相比，除H₆、H₈和S₆ 外，其余营养液均显著提高绞股蓝鲜重和干重。其中，Y₆营养液处理的绞股蓝单株鲜重和单株干重最大， 平均值分别为1849.63 mg 和136.97 mg；A₇营养液次之，S₇、S₈、Y₇、A₆和A₈鲜重均在1500 mg 以上，干重均在100 mg 以上。H₆、H₈和S₆营养液处理的绞股蓝重量较小，且H₆处理的单株鲜重、S₆和H₈处理的单株鲜重和单株干重均低于对照，表明这3 种培养液不利于绞股蓝生物量积累。

2.1.2 不同营养液对绞股蓝幼苗根系活力的影响从图1 可以看出，不同营养液培养条件下绞股蓝的根系活力差异显著。其中，Y₆培養的绞股蓝根系活力最高，四氮唑还原强度达139.06 mg/（g·h）；其次为S₇、Y₈、A₇和A₈处理，四氮唑还原强度在90 mg/（g·h）以上；而S₆、S₈处理后绞股蓝根系活力较低，分别为23.98 mg/（g·h）和33.65 mg/（g·h），显著低于对照。

2.1.3 不同营养液对绞股蓝总皂苷积累的影响从图2A 可以看出，不同营养液处理后绞股蓝总皂苷含量差异较大。清水培养的绞股蓝（CK）总皂苷含量仅1.73%，而H₆、H₇、Y₆处理后绞股蓝总皂苷含量均超过2.00%，其中以H₇处理的总皂苷含量最高，为2.40%。A₇处理的总皂苷含量显著低于对照，其余处理的总皂苷含量与对照无显著性差异。由于不同营养液处理后绞股蓝单株干重存在明显差异，因此对绞股蓝单株总皂苷量进行了计算。由图2B 可知，Y₆处理后绞股蓝单株总皂苷量最高，达3.03 mg，显著高于其他处理。其次为H₇、S₇、Y₇和A₆处理，其单株总皂苷量在2 mg 以上。清水对照（CK）、H₆、H₈、S₆及Y8处理的绞股蓝单株总皂苷量较低，均低于1 mg。

对各测定指标进行相关性分析发现，绞股蓝单株总皂苷量与株高、叶长、叶宽、叶片数、单株鲜重、单株干重呈高度正相关（相关系数大于0.9，P<0.01）（表6）。因此，在绞股蓝水培过程中培育高生物量植株是获取高活性成分植株的关键。对绞股蓝水培后植株的生长情况、总皂苷含量等多项指标进行综合分析，认为pH 为6.0 的日本园试营养液能够促进绞股蓝生长及主要活性物质积累，是绞股蓝水培生产的最佳营养液。

2.2 不同光照条件对绞股蓝生長及总皂苷积累的影响

2.2.1 不同光周期对绞股蓝生长及总皂苷积累的影响 为明确水培过程中绞股蓝幼苗对光照条件的要求，开展了光周期及光照强度对比实验。由表7 可以看出，当光周期为每天8 h 光照/16 h 黑暗时，绞股蓝株高和茎粗较高，但根长、叶长、叶宽、叶片数、单株鲜重及单株干重均显著低于其他光周期处理。10 h 光照/14 h 黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h 黑暗3 种光周期处理对绞股蓝株高、茎粗、根长、叶长、叶宽、叶片数、单株鲜重及单株干重无显著性影响。

对绞股蓝干样品进行总皂苷含量测定，发现8 h 光照/16 h 黑暗处理的总皂苷含量平均为2.3%；10 h 光照/14 h 黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h 黑暗处理的绞股蓝干样品中总皂苷含量平均值达4.0%以上，且各处理间无显著性差异（图3A）。从单株总皂苷量上看，10 h 光照/14 h黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h 黑暗3种光周期处理显著高于8 h 光照/16 h 黑暗处理（图3B）。因此，绞股蓝水培生长过程中适宜的光周期为每天光照10～14 h。

2.2.2 不同光照强度对绞股蓝生长及总皂苷积累的影响 从表8 可以看出，光照强度对绞股蓝生长有显著性影响。在20 μmol/（m²·s）和100 μmol/（m²·s）条件下，绞股蓝株高较高，二者之间无显著性差异。从茎粗、根长、叶长、叶宽、叶片数、单株鲜重及单株干重来看，以100 μmol/（m²·s）处理最高，表明100 μmol/（m²·s）更适合绞股蓝生物量积累。由图4A 可以看出，各光照处理对绞股蓝干样品总皂苷积累无显著性影响。从单株皂苷量来看，以100 μmol/（m²·s）处理最高，且显著高于20 μmol/（m²·s）和200 μmol/（m²·s）的光照处理。（图4B）。

2.3 不同温度条件对绞股蓝生长及总皂苷积累的影响

从表9 可以看出，温度对绞股蓝幼苗生长有显著性影响。在恒温处理（15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃）中，以25 ℃和30 ℃处理的绞股蓝株高、单株鲜重和单株干重较高。在变温条件下，20 ℃/30 ℃变温处理的绞股蓝的株高、根长、叶片数、单株鲜重及单株干重均显著高于15 ℃/25 ℃变温处理。从总皂苷含量上看（图5A），以20 ℃、25 ℃、30 ℃、15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃处理较高，其中20 ℃/30 ℃处理最高，达5.26%。从单株皂苷量来看（图5B），以20 ℃/30 ℃处理最高，达16.96 mg。综合绞股蓝生长及有效成分积累情况，认为20 ℃/30 ℃是绞股蓝水培的最适温度。

3 讨论

无土栽培中营养液是植物赖以生存的根际环境，也是植物生长的主要营养来源。研究发现，不同营养液对植株产量和品质的影响不同[15-16]。田雅楠等[17]研究发现，日本山崎茄子配方对潮汐式育苗的番茄植株各项生理指标均有促进作用，处理后壮苗指数比霍格兰和阿农配方、日本园试配方高28.26%和81.53%。韦秀叶等[18]利用标准霍格兰营养液（1H）和自主设计的营养液配方（1Z、1/2Z、1/4Z 和1/8Z）对大麻幼苗进行处理，结果表明1/4Z 和1/8Z 为大麻水培的适宜营养液配方。此外，水培植物的生长还与营养液的酸碱度有关。崔佳维等[19]研究发现，生菜、奶白菜、青菜和杭白菜4 种叶菜的产量和营养品质在不同营养液pH 条件下表现不同。随着水培液酸碱度增加，柳枝稷不同品种（系）幼苗的分蘖数、株高、苗鲜重、根冠比、根系活力以及净光合速率均显著降低[20]。本研究对绞股蓝水培的营养液条件进行探索，发现绞股蓝生长及有效成分积累不仅与营养液种类有关，还与营养液的pH 密切相关。使用pH 为6.0 的日本园试营养液进行培养可以获得高生物量和高总皂苷含量的绞股蓝植株。相关性分析结果显示，绞股蓝单株总皂苷量与株高、叶长、叶宽、叶片数、单株鲜重、单株干重呈高度正相关。因此，在绞股蓝水培过程中培育高生物量植株是提高绞股蓝药材质量的关键。

钙、镁、磷、钾是植物生长发育和形态建成所必须的矿质元素。有研究表明，低浓度的磷和适当浓度的钾有利于红椿水培幼苗生长[21]。在低钙浓度范围内，增加钙浓度能够促进烟草水培幼苗对钾的吸收[22]；当镁浓度低于40 mg/L 时，烟草水培幼苗中钙、镁、磷、钾的积累量与营养液中镁浓度呈正相关关系。本研究中不同营養液配方中钙、镁、磷、钾含量不同，但4 种矿质元素的含量对绞股蓝幼苗生长的影响未呈现明显的规律性，其原因可能与绞股蓝生长周期较长而幼苗培养时间较短，导致植株形态特征差异不明显有关。氮素水平和氮素形态配比不但影响植物生长，还影响植物次生代谢产物积累。研究发现，当硝态氮与铵态氮配比为75∶25 时，三七的生物量及皂苷含量较高[23]。在水培液中增加氮的浓度可显著增加拟巫山淫羊藿的生物量，并影响黄酮的积累[24]。本研究中，日本园试营养液中氮含量最高，华南农业大学叶菜A 营养液中氮含量最低；改良Hoagland 营养液中硝态氮与铵态氮的比例最高，其次为日本山崎和日本园试配方。绞股蓝单株总皂苷量与营养液中氮含量的高低无关，但较低的硝态氮与铵态氮配比更有利于绞股蓝皂苷积累，其原因有待进一步研究。

光照和温度是植物生长发育的重要影响因素。前人研究表明，绞股蓝生长及有效成分积累与光照条件和环境温度密切相关。刘世彪等[25]研究发现，绞股蓝叶的形态结构受光照强度影响较大，适当遮荫处理有利于植株生长发育；绞股蓝生长发育的最适温度为25 ℃，有效成分积累的最适温度为25～30 ℃[26]。邓铭等[27]认为40%～85%的相对照度有利于绞股蓝生长，相对照度为70%左右时其干物质产量和总皂苷含量最高。本研究发现100 μmol/（m²·s）光照条件及20 ℃/30 ℃变温处理有利于绞股蓝生物量和皂苷积累，与前人研究结果较为一致。其原因可能与绞股蓝对生境的需求有关，绞股蓝原生境为山谷密林、山坡疏林或路旁草丛，均为荫蔽且阴凉的环境。

多项研究表明，不同产地绞股蓝总皂苷含量存在明显差异。彭亮等[28]研究发现，不同产地绞股蓝总皂苷含量相差可达10 倍以上。马泽刚等[29]研究发现，绞股蓝总皂苷含量从高到低的产地排序为：江西>广东>云南>陕西>内蒙古>福建>四川>湖北。潘春柳等[30]发现广西不同产地来源的绞股蓝总皂苷含量亦存在明显差别。实现绞股蓝标准化生产是获取高质量药材的关键，然而目前在绞股蓝药材质量控制方面尚无统一定论。《山东省中药材标准》（2002 年版、2012 年版）[31-32]、《湖北省中药材标准》（2009 年版）[33]规定绞股蓝总皂苷含量分别为2.0%和0.18%，其他省区中药材标准未涉及绞股蓝药材质量要求。本研究中，使用pH 为6.0 的日本园试营养液对绞股蓝进行水培，在环境温度为20～30 ℃，光周期为每天光照10～14 h，光照强度为100 μmol/（m²·s）时，培养30 d后其干样品总皂苷含量高于3%，高于现有标准。因此，使用规范化水培技术可同步实现绞股蓝产量和品质的双精准调控。本研究为今后开展绞股蓝规模化生产、质量标准研究打下了基础。