SSR荧光标记毛细管电泳分析24个广西常规香稻品种的遗传多样性

唐梅　孙富　何 聪　卢宏琮　黄 鹂　夏秀忠　唐忠平　钟志坚　陆桂耀

关键词：广西；常规香稻；SSR 荧光标记；毛细管电泳；遗传多样性

中图分类号：S511 文献标识码：A

随着近年来消费者对稻米品质要求的不断提高，优质香稻品种以饭香浓郁和营养丰富等优异品质越来越受到市场的青睐。从1980 年我国开始进行香稻育种，目前已经育成一批优质香稻品种[1]。广西在2000 年以来也相继育成了‘八桂香[2]、‘田东香[3]、‘玉香占[4]、‘三香628[5]等香稻品种。但由于广西自育香稻品种的优质米达标率低、产量低和抗病性差等原因，推广的香稻品种数量和质量满足不了市场需求[6]。为了满足当前消费者对稻米品质好闻、好吃、好看、高营养的理想追求，因此广西加快了优质常规香稻新品种的审定。而在香稻育种中，有香味基因的亲本来源较少，且遗传背景较近，从而使得香稻品种的遗传多样性较低[1]。通过对香稻品种的遗传多样性进行分析，理清香稻品种的亲缘关系，加强香稻品种的遗传特性研究，可为选育广西优质香稻品种提供技术参考。

DNA 分子标记技术分析水稻品种遗传多样性是目前应用最广泛的手段之一，其中简单重复序列（simple sequence repeat， SSR）标记数量丰富、多态性好、稳定性高、操作方便，可利用SSR 标记对香稻进行遗传多样性分析[7-13]。唐傲等[9]利用60 个SSR 标记对国内外370 份香稻材料的遗传多样性进行了比较分析，结果发现参试材料可分为籼粳两大类。朱勇良等[10]利用40 对SSR 引物对太湖稻区和国内其他地区的39 个香稻品种进行遗传多样性分析，试验结果基本反映了不同品种间的亲缘关系。赵凤民等[13]用50 对SSR 分子标记对42 份黑龙江省香稻种质资源进行遗传多样性研究，结果说明香稻资源的区域特征明显，各类群中的香稻资源亲缘关系较近。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的方法步骤繁多，耗时耗力且灵敏度低。而SSR 荧光标记毛细管电泳技术可直接读取目的片段准确大小，大大降低了分辨扩增产物的难度，提高了研究的效率和准确性。利用SSR 荧光标记毛细管电泳技术用于香稻特别是涉及广西常规香稻品种遗传多样性的研究还未见报道。本研究采用SSR 荧光标记毛细管电泳检测技术，利用48 对SSR 分子标记对广西审定的24 个常规香稻品种进行遗传多样性分析，以期分析广西常规香稻品种间的遗传多样性，闡明广西常规香稻的遗传多样性特点，为广西常规香稻品种的遗传基础拓展、品种选育和鉴定提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以通过广西审定的24 个常规香稻品种为材料（表1）。种子由广西壮族自治区种子管理站提供。

1.2 方法

1.2.1 广西常规香稻品种DNA 的提取 将香稻种子发芽7 d 后，剪取新鲜叶片，采用CTAB 法提取幼苗叶片中的DNA。

1.2.2 SSR 荧光引物及PCR 反应 48 对SSR 核心标记引物由农业行业标准（NY/T 1433—2014）推荐，荧光引物由上海生工生物公司合成。12 μL的SSR 反应体系包括2×PCR Master Mix 5 μL，ddH2O 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL 。PCR 反应在T100 PCR 仪（BIO-RAD， USA）上进行，PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保温。

1.2.3 产物分析 取PCR 产物0.3 μL、分子量内标0.5 μL 和去离子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR板，95 ℃变性5 min，迅速冷却到4 ℃后离心，在ABI3730XL DNA 遗传分析仪上进行毛细管电泳，并用Data Collection 软件收集电泳原始数据。

1.3 数据处理

利用Genemapper 软件分析原始数据，计算扩增片段大小。按照毛细管电泳迁移位置，用1 和0 分别代表检测到扩增片段的有无，建立原始数据表。利用POPGENE 1.32 软件统计观测等位基因数（Na）、Shannons 信息指数（I）、有效等位基因数（Ne），利用NTSYS 2.10e 软件对各品种进行遗传相似性分析，采用UPGMA（unweighted pairgroup method  with average）法对各品种进行聚类分析，利用PIC-CAL 计算多态信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2.1 48 对SSR 标记的多态性分析

本研究利用覆盖水稻12 条染色体的48 对SSR 引物对24 个广西常规香稻品种进行等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannons指数（I）和多态信息含量值（PIC）检测（表2）。结果表明，48 个SSR 位点在24 个广西常规香稻品种中检测到170 个等位基因，等位基因数（Na）的变化幅度为1～9 个，平均为3.54 个，说明这些引物可适于24 个广西常规香稻品种的遗传多样性检测。有效等位基因数（Ne）的变化幅度为1～4.5534，平均为2.0736，其中有效等位基因数最高是RM21，其指数为4.5534，其次是RM481、RM493 和RM258，其指数分别为4.5000、4.4825和4.1739。说明这4 对引物有较高的检测效率。Shannons 指数（I）的变化幅度为0～1.7942，平均为0.7726。多态信息含量（PIC）大于0.50 的位点为高度多态位点，在0.25～0.50 为中度多态位点，小于0.25 时为低度多态位点[14]。24 个广西常规香稻品种的PIC 值的变化范围为0～0.7541，平均为0.3732，属于中度多态位点，说明24 个广西常规香稻品种具有一定的遗传变异。

2.2 遗传相似性分析

使用NTSYS 2.10 软件计算24 个广西常规香稻品种的遗传相似性系数（表3），由表3 可知，24 个品种的遗传相似系数介于0.3299～0.9600 之间，平均值为0.5790，其中‘三香628（11）与‘农香32（19）遗传相似系数最小，为0.3299，说明这2 个品种遗传基础差异最大，亲缘关系最远；‘万香696（14）与‘广粮香2 号（15）、‘万香696（14）与‘粮发香丝（16）、‘广粮香2号（15）与‘粮发香丝（16）之间的遗传相似性系数大， 其数值分别为0.9600 、0.9293 和0.9216，说明这几个品种遗传基础差异较小，亲缘关系接近。

2.3 聚类分析

在遗传相似性系数的基础上采用UPGMA 法对24 个广西常规香稻品种进行聚类分析（图1），在遗传相似性系数0.504 处分为三大群类。第Ⅰ大类包括‘八桂香（1）和‘农香32（19）2 个品种，说明这2 个品种遗传背景较为接近；第Ⅲ大类包括‘早香一号（2）、‘玉香占（4）和‘家福香1 号（10）3 个品种，说明这3 个品种具有相近的遗传背景，与其他品种遗传关系较远；其余19 个品种被分到第Ⅱ大类。进一步遗传分析表明，第Ⅱ大类在遗传相似系数0.624 处又可分为4个亚类，第ⅰ亚类只有‘桂香2 号（3）1 个品种；第ⅲ亚类有‘三香628（11）、‘桂香99（21）和‘桂香18（23）3 个品种；第ⅳ亚类只有‘柳丰香占（9）1 个品种；剩余14 个品种划分到第ⅱ亚类。本研究基本反映了24 个常规香稻品种的亲缘关系。

2.4 SSR 指纹图谱的构建

从48 对标记中筛选出14 对等位基因数、基因多样性指数、Shannons 指数和PIC 值较高的标记，根据检测到的引物等位基因差异，建立24 个广西常规香稻品种的指纹图谱。对14 个标记的扩增片段按分子量大小排列，并进行数字编码（表4）。按表4 顺序将14 对标记对应的编码组合，每个品种可得到唯一的数字编码，组成每个品种的DNA 指纹图谱（表5）。如‘三香628（11）的SSR 指纹编码如下，毛细管电泳检测到14 个标记在‘三香628（11）中的扩增片段大小（bp）为192/192、148/148、169/169、194/194、170/170、179/179、162/162、147/147、136/136、263/263、148/148、186/186、106/106、164/164，转换成28位的指纹数字代码为1122 5511 2244 4411 33663333 3311，其中第1、第2 位的“1、1”表示標记RM583 在‘三香628（11）中的扩增片段（192/192）在其多态性片段中2 个片段排第1 位，第3、第4 位的“2、2”表示标记RM71 的2 个扩增片段（148/148）在其多态性片段中2 个片段排第2 位（表4），其余24 位类推。

3 讨论

广西香稻的种植历史比较悠久[6]，早在南宋时靖西香糯就被列为朝廷贡品，目前仍是驰名中外的优良品种。但是由于近年来广西市场上可用的香稻品种不多，无法满足消费者对香稻的需求。因此加快广西香稻品种的选育和推广对广西香稻产业有着十分重要的意义。而研究广西常规香稻品种的遗传多样性，分析香稻品种之间的亲缘关系，挖掘和利用香稻的优异基因，可为广西优质常规香稻品种选育提供技术参考。

已有的水稻品种遗传多样性研究中，SSR 扩增产物主要由聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[15-17]，较难准确读出扩增片段大小，并且整合不同试验批次和不同胶板的数据是个难题，容易出现人为的误读或错读。SSR 荧光标记毛细管电泳检测可直接读出扩增的目标片段大小，检测数据更为准确[18-20]，便于遗传多样性分析数据整合及分析。

本研究利用国家农业行业标准（NY/T 1433—2014）推荐的48 对SSR 引物，应用SSR 荧光标记毛细管电泳检测技术对24 个广西常规香稻品种进行遗传多样性，可准确有效地分析24 个广西常规香稻品种遗传多样性。结果表明，在48 个SSR 位点上检测到等位基因数170 个，等位基因数变化幅度为1～9 个，平均为3.54 个；比云南地方香稻品种[21]检测到的平均等位基因5.44 个和黑龙江香稻[13]检测到的平均等位基因4.08 个低。PIC 值的变化范围为0～0.7541，平均值为0.3732，比云南地方香稻[21]的0.4300 和黑龙江香稻[13]的0.4649 低。说明广西审定的常规香稻品种的遗传背景比较接近，其遗传多样性不够丰富。这与陈远孟等[22]的研究结果相似。

本研究利用NTSYS 2.10 软件计算24 个广西常规香稻品种的遗传相似性系数，结果显示24 个品种的遗传相似系数介于0.3299～0.9600 之间，平均为0.5790，低于太湖地区香稻品种的0.6400[10]，但高于云南地区香稻的0.4700[21]，进一步说明广西香稻品种具有一定的遗传多样性，但不够丰富。在遗传相似性系数的基础上采用UPGMA 法对24份广西常规香稻品种进行聚类分析。结果发现在遗传相似性系数0.504 处24 个品种可分为三大群类，第Ⅰ大类包括2 个品种，第Ⅱ大类包括19 个品种，第Ⅲ大类包括3 个品种。而第Ⅱ大类在遗传相似系数0.624 处又可分为4 个亚类。聚类分析结果表明，虽然三大类群间部分品种存在一定遗传差异，但遗传多样性还不够丰富，其原因可能是广西香稻种质资源遗传基础较窄，且育种单位的亲本材料遗传背景相近[22]。因此在育种的亲本选择上可引入国内外地缘关系较远和遗传背景差异较大的香稻种质资源。

DNA 指纹图谱具有特异性，比表型鉴定更能准确地鉴定品种（系），可为品种选育和鉴定提供参考[23]。本研究利用SSR 荧光标记毛细管电泳对24 个广西香稻品种进行SSR 荧光标记毛细管电泳检测，从48 对SSR 引物中筛选出14 对多态性较好的SSR 构建了24 个广西常规香稻品种的DNA 指纹图谱。可完全将24 个广西常规香稻品种区别开来，适于24 个广西常规香稻品种的品种鉴定。本研究建立的24 个广西常规香稻品种DNA指纹图谱，可大幅提高24 个香稻品种鉴定的准确度，对广西香稻品种的鉴定和保护具有现实意义。

虽然广西香稻品种具有一定的遗传多样性，但由于其亲本来源较单一，遗传基础狭窄。因此要培育更好的香稻品种或进行品种改良，应多引进国内外丰富的香稻资源，挖掘更多的优异基因导入到广西香稻品种中，以拓宽广西香稻品种的遗传基础，从而培育更好更优异的知名香稻品种，打响广西香米品牌。本研究结果可为广西香稻品种的育种亲本选配和开发新的遗传资源提供参考。