109份丰产核桃单株坚果表型多样性分析及性状评价

张赟齐,董宁光,郝艳宾,陈永浩, 张俊佩,侯智霞,苏淑钗,吴佳庆, 齐建勋*

(1.北京市农林科学院林业果树研究所,农业农村部华北都市农业重点实验室,北京 100097;2.林木遗传育种国家重点实验室,国家林业和草原局林木培育重点实验室,中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091;3.省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,北京林业大学,北京 100083)

核桃(Juglansregia)是温带地区栽培面积最广的重要经济树种[1],具有较高的营养和药用价值,被联合国粮农组织(FAO)列入优先发展的植物名录[2],广泛种植于中亚、东亚、南欧、北非、美洲和西印度群岛等地[3]。核桃是我国重要的食用坚果和木本油料树种,2020年我国核桃坚果产量达479.59万t[4],在增加农民收入、保障国家粮油安全以及实现乡村振兴等方面发挥了重要作用。

良种选育是核桃产业发展的关键,世界各核桃主产国一直在结合产业需求提出适合阶段性发展且兼具一定特色的育种目标[5-7]。近年来,国内外学者们持续开展了通过坚果表型筛选优良基因型的研究。Poggetti等[8]对意大利东北部野生核桃资源开展了坚果表型分析并制定了多元变量指数表用于资源评价;Khadivi等[9]对伊朗主要核桃产区的核桃资源进行了坚果表型分析,以坚果单果质量、核仁单果质量和出仁率作为核心指标筛选优良资源;国外其他地区也相继开展了核桃坚果表型分析工作并筛选出适宜本地区发展的优良基因型[10-13]。国内有关核桃坚果表型多样性及品系选优的研究一直在持续开展,中国林业科学研究院研究团队在核桃起源分布的重要区域西藏[14]和秦巴山区[15]开展了核桃坚果表型差异和遗传多样性的研究,其他科研院所也开展了相应地区核桃种质资源的调查和研究工作[16-24]。

京冀地区是我国传统的核桃主产区之一,其中早实核桃占该地区核桃种植面积的80%以上,早实核桃结实早、早期收益高,对栽培管理要求更细致,粗放管理容易发生早衰现象并引发病虫害,导致产量品质的迅速衰退[25],适时进行优良品系(种)的更新和优化是防止早衰的有效途径之一。为筛选和创制适用于本地区栽植的核桃优系(种),本研究评估了北京市农林科学院核桃选种圃的坚果表型多样性,并基于主成分分析和隶属函数法对种质资源进行了综合评价。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料均取自北京市农林科学院林业果树研究所核桃研究室的选种圃(116°56′3″E, 40°4′0″N),大田管理措施一致。2001—2009年,选种圃累计实生繁育选种群体[‘香玲’(J.regiacv. Xiangling)后代、‘新新2号’(J.regiacv. Xinxin 2)后代、‘温185’(J.regiacv. Wen 185)核桃后代和北京本地核桃优株后代]5万余株,目前保留了300余株处于稳产期、长势良好、丰产性较好和抗寒性较强的优株(系),2020年9月复选出果实病虫害少、抗病虫害较强的109株(品系编号对应序号见表1),每株树随机选择30个果实,统一脱皮晾干后装入自封袋运回实验室,冷藏保存用于表型测定。

表1 109份核桃种质资源编号及名称

1.2 表型测定方法

核桃坚果表型性状的测定依据GB/T 26909—2011《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南:核桃属》进行。 坚果的纵径(length,L)、横径(width,W)、侧径(thickness,T)、壳厚(shell thickness,TS)用电子游标卡尺(精度为0.01 mm)在横径中部进行测量;单果干质量(nut weight,mN)、核仁干质量(kernel weight,mK)、膈膜干质量(diaphragm weight,mD)和种壳干质量(shell weight,mS)用天平(精度为0.01g)称量。

通过坚果三径和干质量指标,可以计算坚果的一系列其他表型参数[26-27]:

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

式中:Lmajor表示三径里最大值,Lminor表示三径最小值。体积出仁率表示单位体积、单位质量坚果所含的核仁质量,可在一定程度上反映核仁的充实饱满程度。

1.3 数据处理

使用Excel 2010进行数据整理,计算各性状平均值、标准差和变异系数;使用SPSS 20.0完成多元统计分析,包括采用Duncan多重比较法检验差异性、采用Pearson方法进行相关性分析、采用主成分法对坚果表型性状进行降维分析、采用欧氏遗传距离(Euclidean distance)结合离差平方和法(Ward’s method)对核桃坚果数量型性状进行聚类分析;采用Shannon-Wiener 指数来描述遗传多样性;采用主成分分析和隶属函数相结合的方法计算综合评价值(D)评价坚果表型性状[28]。

2 结果与分析

2.1 核桃坚果表型性状遗传多样性及相关性分析

对109份核桃优株(系)的18项坚果表型性状指标进行统计分析,结果见表2。由表2可知,核桃各性状产生了不同程度的遗传分化,变异系数为4.70%～25.00%,均值为13.41%;遗传多样性指数在2.849～3.023之间,均值为2.94;方差分析的F值显示坚果表型性状的变异均达到极显著水平(P<0.01),个体间存在较大的遗传差异,遗传多样性较为丰富。

表2 109份核桃种质资源坚果表型性状的遗传多样性分析

种壳干质量分化最大(变化幅度2.81～10.77 g),变异系数为25.00%;其次为体积出仁率(变化幅度1.29～4.75 cm-3),变异系数为24.05%;膈膜干质量、壳厚、体积、单果干质量、核仁干质量和表面积的变异系数也均超过10.00%,显示出坚果大小和干质量指标具有较高的离散程度;球形度的分化程度较小(变化幅度0.82～1.02),变异系数为4.70%,个体间变异较小。

对核桃坚果18个表型性状进行相关性分析(表3)发现,性状大多具有显著相关性。坚果三径是衡量坚果大小的主要参数,与算术平均直径、几何平均直径、表面积和体积的相关性均较高(高达0.8以上),与体积出仁率的关系均呈极显著负相关;壳厚与种壳干质量、出仁率的关系最为密切;单果干质量和核仁干质量、种壳干质量的关系最为密切,干质量指标与反映坚果大小的指标均呈极显著正相关;坚果的形状指标(长宽比、果形指数、伸长率和球形度)均与坚果三径关系密切;出仁率与壳厚、坚果干质量和种壳干质量均呈极显著负相关;体积出仁率与坚果大小、干质量指标均呈极显著负相关,与出仁率呈显著正相关。

表3 109份核桃种质资源坚果表型性状的相关性分析

2.2 核桃坚果表型性状的主成分分析

对109份核桃资源的18个坚果表型性状进行了主成分分析,结果见表4。以特征值1.0为标准提取出3个主成分,其累积贡献率达到91.596%,能反映坚果表型性状的大部分信息。

表4 109份核桃种质资源坚果数量性状的主成分分析

第1主成分特征值最大(9.790),贡献率也最大,为54.39%,特征向量中正向载荷较高的性状有坚果三径、表面积、体积、干质量等,其特征向量值均高于0.7,这些性状反映了坚果的大小,而负向载荷较高的是体积出仁率,特征向量值为-0.949。第2主成分特征值为4.356,贡献率为24.203%,正向载荷较高的性状有长宽比、果形指数和球形度,其特征向量值均高于0.9,负向载荷较高的性状是纵径和伸长率,其特征向量值分别为-0.640和-0.951,这类性状与坚果的形状有关。第3主成分特征值为2.341,贡献率为13.003%,正向载荷较高的性状为出仁率(0.936),负向载荷较高的性状是壳厚和种壳干质量,其特征向量值分别为-0.880和-0.612,属于坚果的外在品质指标。

为直观揭示各表型性状之间的关系,绘制了坚果各表型性状的主成分散点图(图1)。长宽比、果形指数和球形度在坐标系的同一投影区域且较为接近,坚果横径、坚果侧径、单果干质量、核仁干质量、坚果表面积、坚果体积、算术平均直径和几何平均直径在坐标上的投影也较为接近且处在同一区域,表明这些指标之间具有很高的正相关性。体积出仁率与出仁率在第1主成分上的投影较为接近,关系密切。相隔较远的性状间关系不密切,与相关性分析的结果一致。

图1 109份核桃种质资源坚果表型性状的三维主成分坐标散点图Fig. 1 Principal coordinate three-dimensional plot of phenotypic traits of 109 walnut germplasm resources

2.3 核桃坚果表型性状的聚类分析

将坚果的18个表型性状数据标准化后,对109份核桃资源进行聚类分析,在欧氏距离为9.0时,可分为4大类群(图2,编码指代的具体品系见表1)。第Ⅰ类群包括了44份资源,坚果较大[(25.59±2.47)cm3],果形较圆,平均出仁率较高[(56.44±3.16)%],但平均体积出仁率略低[(2.22±0.21) cm-3];第Ⅱ类群包括了26份资源,坚果中等大小[(22.49±2.42)cm3],椭圆形,种壳最薄[(1.24±0.31)mm],平均出仁率最高[(58.37±5.32)%],平均体积出仁率较高[(2.63±0.40) cm-3];第Ⅲ类群包括了25份资源,小果型[(17.47±2.99)cm3],近球形,平均出仁率较高[(54.79±4.36)%],平均体积出仁率最高[(3.22±0.55)cm-3],核仁充实饱满;第Ⅳ类群包括了14份资源,坚果大[(30.93±4.26)cm3],近球形,坚果各部分干质量的数值均最高,平均出仁率略低[(53.03±4.73)%],体积出仁率最低[(1.74±0.25)cm-3]。

图2 基于坚果表型性状的109份核桃种质资源聚类分析Fig. 2 Cluster analysis of 109 walnut germplasm resources based on phenotypic traits

2.4 核桃坚果表型性状评价结果

将109份核桃资源的坚果表型性状数值标准化,根据3个主成分的贡献率和隶属函数模型,计算出相应综合得分并进行排序。综合分值越高,表明坚果表型性状的综合表现越好,综合得分排序见表5。109份核桃资源的坚果表型性状综合分值范围为0.122～0.807,综合分值的平均值为0.454,品系DY的坚果性状综合表现最佳(0.807),而D2-3的综合分值最低(0.122)。根据综合得分,并结合聚类分析的结果,排序得到4大类群中综合表现最佳的种质资源:第Ⅰ类群中编号为XJ59的坚果性状综合得分最高(0.597);在第Ⅱ类群中编号为W17的坚果性状综合得分最高(0.498);在第Ⅲ类群中编号为XJ16的坚果性状综合得分最高(0.500);在第Ⅳ类群中编号为DY的坚果性状综合得分最高(0.807)。

表5 核桃坚果表型性状综合得分排序表

3 讨 论

3.1 核桃坚果表型性状的多样性

坚果表型分析是性状评价的重要组成部分,对栽培方案制定和区域品种选择尤为重要,通过比较坚果的表型性状可以有目的地进行品种选育和改良。果壳厚度、果仁和坚果质量等果实性状具有较高的狭义遗传力,被认为是最具鉴别力和稳定性的形态性状[28-29],而不同基因型的核桃坚果性状(如坚果大小、形状、壳厚、核率、核色等)会因高杂合度而表现出较高的变异性。

坚果大小、干质量、壳厚和出仁率等作为主要的表型性状,引起了学者们更多的关注,以期用于核桃商业品种的开发利用。欧洲核桃主产区的坚果表型性状研究[8, 30-32]显示,坚果干质量范围为2.2～27.9 g,核仁干质量1.0～13.9 g,出仁率为18.7%～63.8%,壳厚0.4～2.3 mm。伊朗作为核桃重要的起源中心之一,已有相关研究显示坚果干质量范围为3.6～23.0 g,核仁干质量为1.3～14.0 g,出仁率为17.4%～83.9%[9-10, 33-34]。国内核桃坚果表观性状的相关研究[14-24]也一直在持续开展,已有的研究结果显示,坚果干质量范围为3.5～35.0 g,核仁干质量为1.8～13.8 g,出仁率为10.2%～74.3%,壳厚0.2～2.7 mm。目前,育种学家们[8-9, 34]普遍接受的理想核桃坚果具有以下特征:坚果干质量为12.0～18.0 g,核仁干质量为6.0～10.0 g,出仁率高于50.0%,壳厚为0.7～1.5 mm。本研究结果显示:坚果干质量为6.96～22.33 g,核仁干质量为3.82～12.37 g,出仁率为41.10～68.62%,壳厚0.72～2.46 mm,其中符合理想坚果特征的基因型有51份,GB/T 26909—2011《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南:核桃属》中更为细致地归纳了核桃坚果分类依据,109份核桃种质资源的坚果大多为中等单果干质量(8.0～15.0 g)、薄壳(1.0～1.5 mm)或高出仁率(50%～60%),其中有45份资源同时具备以上3个特征,14份资源同时具备中等单果干质量、薄壳和极高出仁率(≥60%)的坚果性状特征,11份资源同时具备单果干质量(>15.0 g)、薄壳和高出仁率的坚果性状特征,坚果性状较好。壳厚、干质量和反映坚果大小(表面积和体积)的参数均具有明显的变异性(CV >10%),说明此类性状的分化程度较高,而坚果形状和出仁率等指标的变异系数较低,说明这些性状的变异相对较小,遗传稳定性较好,和前人的研究结果类似[9-11, 13]。

坚果表型性状间的关系有助于区分不同的核桃基因型,也有助于制定育种方案[8, 11, 33]。性状之间的正相关关系表明,一个性状的改善可以促进另一个性状的改善。相关性分析结果显示,核桃坚果18个数量性状间存在一定的相关性。其中坚果尺寸大小与干质量参数呈极显著正相关,坚果越大,其各部分的干质量也越大,干质量较高的坚果可以产生更多的核仁[13];坚果形状指标与坚果三径呈极显著相关,形状取决于三径的比值;出仁率与壳厚、壳质量、坚果干质量均呈极显著负相关,壳越厚、质量越大则出仁率会呈现明显的下降趋势,与前人的研究结论一致[8, 35]。在本研究中,出仁率在不同基因型间的变异较稳定,而干质量的变异较高,出仁率与核仁干质量的正相关性并不显著,与其他研究存在一定的差异[9, 31]。已有研究认为坚果和核仁干质量对出仁率有很大影响[10, 31],而本研究认为,壳厚和壳质量更应该予以重视,在核桃选育过程中,可关注薄壳且尺寸较大的坚果类型。

主成分分析可以通过降维来简化变量以便于识别更突出的变异性状。本研究中,第1主成分反映了坚果的大小(尺寸和干质量),对总方差的贡献率最高,与前人的研究一致[9-11, 15];第2主成分反映了坚果的形状,对总方差的贡献率小于前者;第3主成分反映了坚果的经济性状(出仁率、壳厚和壳质量)。3个主成分解释了91.60%的总变异,反映了坚果表型性状的绝大部分信息。综合相关性分析和主成分分析从18个坚果表型性状中筛选出了8个有代表性的主要表型性状,依次为几何平均直径、坚果体积、单果干质量、核仁干质量、球形度、壳厚、出仁率、体积出仁率。基于聚类分析将109份核桃种质资源分为4大类群,可作为进一步创制新品种的杂交亲本:第Ⅰ类群是可用于培育果型较大、果形较圆、出仁率较高的亲本材料;第Ⅱ类群是可用于培育中等大小、果形椭圆、种壳薄、高出仁率、种仁饱满的亲本材料;第Ⅲ类群是可用于培育小果型、近球形、出仁率较高、种仁饱满的亲本材料;第Ⅳ类群是可用于培育大果型、近球形的亲本材料。

3.2 核桃坚果表型性状的综合评价

基于主成分分析和隶属函数相结合的方法已被广泛应用于植物种质资源的综合评价,可以较全面、客观地反映出表型性状的优异程度,有助于快速筛选出了符合育种目标的优良材料。赵宝军等[36]对与产量密切相关的16个性状进行主成分分析,并结合隶属函数法筛选出具有丰产潜力的优良核桃种质资源。陈善波等[37]对四川地区核桃特异资源进行了调查,通过主成分分析和隶属函数综合评价法筛选到了品质优良的穗状核桃资源。蒲光兰等[17]对四川15个产区的核桃优树资源进行了普查并采用相同的评价方法对产区进行得分排序,结果显示巴塘产区的核桃综合表现最优。坚果的表型性状反映了核桃的商业价值,本研究对选种圃保存的109份丰产单株的坚果表型性状开展了多样性研究和综合评价,综合评价的分值显示DY优系的坚果性状表现最好,排名靠前(占群体数量的前10%)的有XJ45、A265、B99、D30、A068、E030、A082、XJ59、W27和175D2B1,DY优系为北京本地核桃优株后代;XJ45、XJ59和W27均为‘温 185’核桃品种后代;A265为‘新新2号’核桃品种后代;B99、D30、A068、E030、A082和175D2B1均为‘香玲’核桃的后代。其均具有坚果干质量较大、体积大、果形较圆、出仁率较高的特点,是较好的杂交亲本材料。为了避免杂交选育的盲目,还可根据聚类结果,从各类群中选取综合评价分值排名靠前的种质材料,合理组合,以快速实现育种目标[28]。结合理想核桃坚果的一般特征,最终筛选出具有种壳厚度较小的XJ45、A068、E030、XJ59和W27,具有较高的商业开发价值。