受害前后的九里香嫩梢对柑橘木虱的吸引作用及其挥发物成分分析

许 鑫,肖庄婷,柯伟政,张旭颖,王潇潇,岑伊静*

(1. 华南农业大学柑橘黄龙病研究室/广东省生物农药创制与应用重点实验室,广州 510642;2. 中国林业科学研究院高原林业研究所,国家林业和草原局资源昆虫培育与利用重点实验室,昆明 650224)

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama是柑橘类植物新梢期的主要害虫,是柑橘黄龙病的主要传播媒介,国外称为亚洲柑橘木虱。柑橘黄龙病是目前世界柑橘生产上最严重的传染性病害,有亚洲种、非洲种和美洲种,柑橘木虱传播黄龙病亚洲种和美洲种(Halbert &Manjunanth,2004;Coletta,2005)。虽然柚喀木虱CacopsyllacitrisugaYang & Li在2012年被证实也可携带并传播亚洲柑橘黄龙病的病原菌(Cenetal.,2012;周汶静等,2012),但是其分布范围局限在高海拔地区(郭俊等,2012),所以在多数柑橘产区柑橘木虱是黄龙病亚洲种唯一的媒介昆虫。

化学信息物质是植物与昆虫之间最为重要的化学信息纽带,对昆虫行为有着重要的影响,例如寄主植物定向、取食、交配、产卵、逃避、传粉行为及天敌昆虫寄主寻找行为(Tingleetal.,1989;Verkerketal.,1994;Isman,2006;Xu,2018;Maetal.,2019)。而植食性昆虫对寄主植物造成的取食为害能诱导植物改变其挥发物的组成成分,并持续一段时间(Vet &Dicke,2015)。植物在受植食性昆虫为害后,会释放出有别于健康植物的植物挥发物(郝娅和娄永根,2013),从而影响到植食性昆虫的行为,使其对寄主植物更加喜好或厌恶。

柑橘类嫩芽的挥发物对柑橘木虱寻找、定位、识别寄主植物起着重要的作用(Wenningeretal.,2009)。柑橘木虱成虫对芸香科寄主植物具有较强的正趋向反应,特别是最嗜好寄主植物九里香MurrayapaniculateL.(赖剑修和杨清华,1991),推测芸香科植物中的某些挥发性物质成分为木虱寄主搜索行为过程的介导活性物质。本研究在明确了受柑橘木虱为害后的九里香对柑橘木虱的吸引作用增强的基础上,采用极性含多种涂层的50/30 μm DVB/CAR/PDMS对木虱为害前后的九里香嫩梢挥发物分别进行萃取,利用气相-质谱联用仪(GC-MS)分析鉴定挥发物组分,并确定其化学结构,期望可以从寄主植物九里香中筛选出对柑橘木虱有效的引诱成分,开发引诱剂来监测和防治柑橘木虱。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫及植物:柑橘木虱成虫采自于华南农业大学柑橘黄龙病研究室在九里香上饲养的种群;九里香为华南农业大学柑橘黄龙病研究室在防虫网室内隔离种植的3年生盆栽苗,为未受柑橘木虱为害的健康植株。

供试仪器:柑橘木虱选择性试验采用自制H型选择器(PVC材质),该装置两侧为直径25 cm、高30 cm的圆柱(仅顶面开放),中间连接臂为直径1 cm、长10 cm的圆形通道,通道正中间有直径0.5 cm的圆形入口(图1);气相-质谱联用仪(GC-MS)为Shimadzu QP-2010;手动固相微相萃取装置和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头为美国supelco公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1柑橘木虱对未受柑橘木虱为害和受为害的九里香的选择性试验

(1)柑橘木虱对正受柑橘木虱为害的九里香的趋性:选取两盆长势相似均未受木虱为害的九里香,分别放入自制“H”型选择器的两侧圆柱中,其中一盆九里香接50头柑橘木虱成虫,让其在九里香植株上取食,保鲜膜密封顶端开口以防木虱逃逸。24 h后,在不将正在取食的木虱取出的情况下,将30头木虱成虫从测试装置连接臂的圆孔释放到装置内,让其自由选择,分别统计进入两侧圆柱的木虱虫数,测试60头后,调换选择器的位置,消除光线和几何位置影响。试验重复4次,总共测试120头虫。

(2)柑橘木虱对已受柑橘木虱为害的九里香的趋性:选取两盆长势相似并未受木虱为害的九里香,分别放入自制“H”型选择器的两侧圆柱体中,选其中一盆九里香接50头木虱,24 h后将这些木虱全部取出,并用保鲜膜密封。然后测定柑橘木虱成虫对受害和未受害九里香的趋性,测定方法同(1)。

图1 H型选择器示意图Fig.1 Sketch of H-type selector

1.2 试验方法

1.2.2柑橘木虱为害前后九里香挥发物的提取与分析

(1)顶空固相微萃取柑橘木虱为害前后的九里香嫩梢挥发物

选取两盆长势相似并未受木虱为害的九里香,选其中一盆取20 g左右的嫩梢放入20 mL顶空瓶中,然后密封,把固相微萃取装置的萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入玻璃瓶内萃取其挥发物5 h。另一盆九里香接50头木虱成虫进行为害24 h后,将木虱全部移出,再取20 g的嫩梢放入顶空瓶中,后续处理方法和上述一致。

(2)木虱为害前后九里香嫩梢挥发物的GC-MS分析

将萃取头插入GC-MS进样口,250℃热脱附样品5 min进行色谱柱分析。条件参照(万珊等,2010;杨玉枝等,2015)。GC条件:色谱柱为HP-5毛细管柱,规格为:30 m×0.25 mm×0.25 mm,载气为高纯氦气(He),载气流速为1 mL/min,无分流进样。进样口温度:250℃,起始色谱温度45℃保持3 min,以3℃/min梯度上升至135℃保持2 min,然后以8℃/min升至250℃保持5 min。MS条件:EI检测器,接口温度280℃,离子源温度230℃,离子能70 ev,EI质量范围40～500 amu/s,将采集到的质谱图与标准谱库进行核对并分析。

1.3 数据分析

数据先用Microsoft Office Excel 2013进行初步归纳,然后采用生物统计学分析软件IBM SPSS Statistics 22.0配对样本t检验和独立样本t检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 未受为害和受为害的九里香对柑橘木虱的吸引作用

柑橘木虱在“H”型选择器中选择未受柑橘木虱为害或受为害的九里香的结果如图2所示。在将木虱取出和不取出两种情况下,柑橘木虱选择受害和未受害九里香的虫口数差异都极显著,被为害的九里香对木虱的吸引作用都显著增强(t分别为6.971、8.660,P分别为0.006、0.003)。在未取出木虱(继续受为害)的情况下,柑橘木虱对受害九里香的选择率达到75%±3%;在为害24 h后将木虱取出的情况下,柑橘木虱对受害九里香的选择率则降至65%±2%,表明带有柑橘木虱的受害九里香对柑橘木虱的吸引作用更强(t=2.77,P=0.032)。

2.2 柑橘木虱为害前后九里香挥发物的提取与分析

2.2.1挥发性化合物分析

柑橘木虱为害前后的九里香嫩梢挥发性成分均含有烯烃类、醇类、酯类等物质(表1)。

未被为害的九里香挥发性化合物主要含有16种,相对含量从高到低依次为α-姜烯(9.67%)、β-石竹烯(4.37%)、2,6-二叔丁基对甲酚(4.2%)、(S)-β-甜没药烯(3.29%)、1-(1,5-二甲基己基)-4-甲基苯(2.43%)、香树烯(2.04%)、B-倍半水芹烯(1.97%)、α-香柠檬烯(1.67%)、α-柏木烯(1.44%)、甘香烯(1.35%)、桉油烯醇(1.31%)、α-姜黄烯(1.21%)、(R)-β-雪松烯(1.18%)、(+)-喇叭烯(1.1%)、乙酸叶醇酯(1.04%)、β-榄香烯(0.99%)。

木虱为害后的九里香挥发性化合物主要含有15种,相对含量从高到低依次为B-倍半水芹烯(5.63%)、β-石竹烯(5.61%)、α-姜黄烯(5.13%)、(S)-β-甜没药烯(4.71%)、甘香烯(3.81%)、顺式-β-金合欢烯(3.66%)、(R)-β-雪松烯(3.26%)、(+)-香橙烯(3.03%)、α-香柠檬烯(2.51%)、香树烯(1.74%)、Epi-β-檀香烯(1.33%)、α-姜烯(1.26%)、十四甲基环七硅氧烷(1.24%)、(+)-喇叭烯(1.16%)、2,6-二叔丁基对甲酚(1.07%)(表1)。

图2 柑橘木虱对未受其为害和已受其为害九里香的选择性Fig.2 Selectivity of citrus psyllids to Murraya paniculate of undamaged or damaged by psyllid注:“**”表示同组数据经配对样本 t 检验在0.01水平上差异显著。Note: “**” indicated that the same group of datas were significantly different at the 0.01 level by the paired sample t test.

2.2.2挥发物相同组分化合物的相对含量变化

在木虱为害前后九里香释放的同种化合物中,一些成分的相对含量差异比较明显,在被为害后的九里香中,α-姜黄烯、β-倍半水芹烯、甘香烯、(R)-β-雪松烯、(S)-β-甜没药烯、β-石竹烯、α-香柠檬烯、(+)-喇叭烯等物质相对含量明显高于未被为害的,而α-姜烯、2,6-二叔丁基对甲酚、桉油烯醇、Delta-杜松烯、乙酸叶醇酯、香树烯等物质相对含量明显低于未被为害的(表1)。

2.2.3挥发物化学成分的差异

木虱为害前后的九里香挥发性化学物质组分的差异较大,其中孕烯醇酮(图3-A25)、β-榄香烯(图3-A24)、2,6-二叔丁基苯醌(图3-A13)、异丙茴香醚(图3-A10)、1-(1,5-二甲基己基)-4-甲基苯(图3-A9)、α-柏木烯(图3-A8)这 6种仅存在于未被为害的九里香中,而γ-橄榄烯(图3-B21)、α-愈创木烯(图3-B12)、Epi-β-檀香烯(图3-B13)、顺式-β-金合欢烯(图3-B14)、(+)-香橙烯(图3-B15)、α-菖蒲二烯(图3-B17)、十四甲基环七硅氧烷(图3-B18)、α-绿叶烯(图3-B29)共8种仅存在于被为害后的九里香中(表1)。

表1 HS-SPME提取柑橘木虱为害前后的九里香嫩梢挥发性成分分析结果

续表1 Continued table 1

图3 九里香挥发物色谱图Fig.3 Chromatogram of Murraya paniculate volatiles注:A,未受柑橘木虱为害;B,已受柑橘木虱为害。Note: A, undamaged by psyllid; B, after damaged by psyllid.

3 结论与讨论

本研究结果显示相比于未受害九里香,被柑橘木虱为害过的九里香对柑橘木虱成虫的吸引作用显著增强。Loughrin等(1995)研究发现相比于健康的寄主海棠叶,日本丽金龟Popilliajaponica为害后的海棠叶对日本丽金龟更具有引诱效果。Carroll等(2008)研究发现草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda为害玉米后释放的萜类等挥发性化合物对其幼虫具有引诱作用,以确定寄主植物的位置。被植食性昆虫为害的寄主植物可能会促进对同种植食性昆虫的吸引作用。

在为害后未将木虱取出和为害后将木虱取出的两种情况下,前者柑橘木虱的选择率(75%±3%)显著高于后者(65%±2%),原因可能是在为害后未将木虱取出的情况下,影响木虱趋性为3种挥发物的混合物(健康九里香挥发物、木虱为害诱导的九里香挥发物、木虱虫体挥发物);而在为害后将木虱取出的情况下,影响木虱选择则为两种挥发物的混合物(健康九里香挥发物、木虱为害诱导的九里香挥发物)。杨桦等(2010)发现竹横锥大象Cyrtotrachelusbuqueti雌、雄成虫的虫体挥发物对异性成虫都有吸引作用,证明虫体挥发物能够对同种其他个体产生吸引作用。

本研究采用顶空固相微萃取和GC-MS方法提取分析受木虱为害前后九里香挥发物的成分。Robbins等(2012)用顶空动态收集健康九里香的挥发物,通过GC-MS分析发现β-石竹烯含量高达7.8%,α-姜烯含量高达4.4%。Arya等(2017)从北阿坎德邦地区(印度)本地种的九里香叶片经水蒸馏提取得到挥发油,通过GC-MS分析发现β-石竹烯含量为(3.25%),α-姜黄烯含量为(3.54%),并且该地区本地种、野生种九里香挥发油成分差异较大。这与本研究利用顶空固相微萃取九里香挥发物收集到的主要组成成分的结果较相似。

受木虱为害前后的九里香嫩梢释放的挥发性化学物质种类差异较大,相同组分化合物的相对含量差异比较明显,这可能是由于柑橘木虱吸食九里香韧皮部汁液时,从唾液腺中分泌一些特殊物质并破坏寄主的防御反应,进而改变寄主植物的挥发性次级代谢产物。乔海莉等(2015)研究发现白木香Aquilariasinensi在受到植食性昆虫黄野螟Heortiavitessoides取食后,会释放虫害诱导植物挥发物,明显多于健康植株的挥发物。顾丁(2009)研究发现健康蚕豆Viciafaba挥发物组成种类(46种)多于南美斑潜蝇Liriomyzahuidobrensis为害诱导的蚕豆挥发物(43种),并且挥发物组成种类差异较大。Rioja等(2016)研究发现较高的叶螨Oligonychusyothersi种群密度和连续叶螨取食可以增加鳄梨Perseaamericana嫩梢挥发物的排放量。这些试验结果与本试验中木虱为害前后挥发性化学物质组成和种类差异较大的结果相似,木虱为害后的九里香挥发物比未受害九里香多两种,可能为虫害诱导产生的物质。。

九里香在受柑橘木虱为害后,会释放出不同于未受害植物的挥发物,进而吸引其它柑橘木虱聚集取食,推测为害前后九里香的差异性挥发物成分可能在柑橘木虱寄主定位行为过程发挥着重要作用,可介导柑橘木虱行为调控的九里香挥发物活性成分有待进一步筛选测试。柑橘木虱的虫体挥发物对其他木虱个体可能也具有吸引作用,但此类挥发物目前还没有研究报道,其活性成分有待研究。

致谢：感谢澳大利亚西悉尼大学Andrew Beattie教授对本研究的热情指导和帮助。