熊蜂成群与未成群蜂王体内氨基酸和脂肪酸含量的比较研究

何金明,孙智禹,牛庆生,刘玉玲,徐 凯

(吉林省养蜂科学研究所,吉林 132108)

蛋白质和脂类物质是生命体的主要组成物质,在昆虫生长发育和繁殖方面发挥着重要的作用。相较于昆虫的个体基本生存需求,其在繁殖阶段对蛋白质和脂类的需求更大。关于动物的饲养试验表明,日粮中添加氨基酸和脂类可提高昆虫的繁殖能力(徐畅等, 2019)。棉象鼻虫Elaeidobiuskamerunicus的人工饲料中必须添加氨基酸才能保障其正常发育和产卵(曾凡荣, 2018)。在桔小实蝇Bactroceradorsalis和昆士兰实蝇Bactroceratryoni的日粮中添加脂肪酸能够提高其羽化率、产卵量和卵孵化率(Changetal., 2010; Moadelietal., 2018)。此外,昆虫的不同生理阶段体内氨基酸和脂肪酸含量也会发生一定变化。如黑胸大蠊Periplanetafuliginosa在若虫期和卵期的氨基酸含量存在较大差异(吴仕筠等, 2008)。黄褐油葫芦Teleogryllusderelictus虫体的脂肪酸含量随着生长发育而逐渐增加,且其在不同阶段(高龄若虫、卵与低龄若虫)间存在显著差异(史树森等, 2005)。比较昆虫不同繁殖阶段体内氨基酸和脂肪酸含量的差异,对探究昆虫繁殖相关的营养物质代谢机制具有重要意义。

熊蜂Bombusspp.是多种野生植物和农作物重要的传粉昆虫,在维护生态平衡和促进农业增收方面发挥着重要作用(Arango-Diagoetal., 2020)。野生的熊蜂多为一年一个世代,其在早春时期结束冬眠后开始产卵,逐渐进入繁殖阶段,子代蜂王交尾后会离群寻找新的越冬场地,而原群则在秋末迅速灭亡。野生熊蜂仅能为春末和夏季的作物进行授粉,为满足冬季和早春设施作物的授粉需求,则必须通过工厂化繁育来打破其固有的繁育周期,实现周年繁育,继而实现规模化饲养。熊蜂工厂化繁育主要包括了滞育、产卵、成群、子代繁育等重要环节,其中成群率低是制约我国实现本土熊蜂工厂化繁育的主要原因之一。成群是熊蜂从独居性向社会性转变的关键时期。许多研究将蜂王培育出10头以上工蜂的蜂群定义为成群,表示该蜂群具有鲜明的社会分工,而到期却未培育出10头工蜂便停产的蜂群则被定义为未成群(Gosterit, 2016)。影响熊蜂成群的因素主要包括品种特性、营养代谢、饲养环境以及繁育方法等。但在熊蜂工厂化繁育中,繁育蜂种、饲养环境和繁育方法相对一致,蜂王体内营养物质代谢则成为决定熊蜂成群的主要因素。目前关于昆虫不同繁殖阶段生理指标测定的研究较少,更未见熊蜂成群阶段蜂王体内营养物质代谢的相关报道。本研究通过测定熊蜂成群与未成群蜂王体内氨基酸和脂肪酸种类及含量,探究两个不同繁殖状态下蜂王体内氨基酸和脂肪酸含量的差异,以期阐释氨基酸和脂肪酸代谢对熊蜂成群的影响,并为工厂化繁育中熊蜂蜂王各繁育阶段精准营养日粮的配制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用熊蜂均为吉林省养蜂科学研究所熊蜂扩繁基地的明亮熊蜂Bombuslucorum,采集的蜂王样本均为同一批次,且饲养环境和繁育方法完全相同。蜂王产卵40 d后在饲养室中分别随机选取成群蜂群(工蜂数量>10头)的蜂王和未成群蜂群(工蜂数量<10头)的蜂王各30头,随机分为3组(10头/组)。采集后的蜂王经编号后立即投入液氮中,随后保存于-80℃冰箱,用于后续氨基酸和脂肪酸含量的测定。

1.2 主要试剂与仪器

17种氨基酸标品均购自上海安谱实验科技股份有限公司;乙腈、异硫氰酸苯酯、正己烷、三氟化硼甲醇均购自CNW;乙醚、石油醚、三乙胺等试剂购自国药集团化学试剂有限公司;35种脂肪酸混合标准品购自Sigma公司。

电子天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司(型号:舜宇恒平FA-1004)、离心机购自Thermo公司(型号:BR4I)、液相色谱仪购自Aglient公司(型号:1260)、气相色谱仪质谱仪购自Thermo公司(型号:Trace1310 ISQ)。

1.3 不同繁殖状态下熊蜂氨基酸、脂肪酸含量测定方法

分别对每个组的10头熊蜂蜂王样品进行混合研磨,并利用高效液相色谱法(HPLC法)和气质联用法(GC-MS)对熊蜂蜂王体内各氨基酸含量和脂肪酸含量分别进行测定。在测定样品氨基酸组成及含量时,使用20 mL 1∶1 HCL对样品进行前处理,110℃电热鼓风干燥箱中水解22 h,冷却后定容至25 mL。取50 μL样品放入真空干燥箱中60℃干燥2 h后在离心管中充氮,加入50 μL衍生试剂后室温衍生30 min,加入流动相A 4.5 mL后混匀,过0.45 μm有机膜上机。

在测定样品脂肪酸组成及含量时,称量适量样品水解后提取脂肪,于100℃烘箱中干燥2 h。向脂肪提取物中加入2 mL 2%氢氧化钠甲醇溶液,85℃水浴30 min,加入3 mL 14% 三氟化硼甲醇溶液,85℃水浴30 min。水浴完成后,温度降至室温后加入1 mL正己烷,震荡萃取2 min,静置1 h。取上层清液100 μL,用正己烷定容到1 mL。用0.45 μm滤膜过膜后上机测试。

样品测定由青岛科创质量检测有限公司完成。

1.4 数据处理

运用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析,并选用Tukey法进行多重比较,最终氨基酸和脂肪酸含量以平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 成群与未成群熊蜂蜂王体内氨基酸差异

2.1.1氨基酸组成

对熊蜂成群与未成群蜂王体内氨基酸组成进行测定,在待检测的17种水解氨基酸中只检测到16种氨基酸,未检测出蛋氨酸(图1)。成群和未成群蜂王体内含量最多的6种氨基酸均为谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸,且以上6种氨基酸含量总和超过了蜂王氨基酸总和的50%。在成群蜂王体内含量由高到低依次为谷氨酸>丙氨酸>亮氨酸>丝氨酸>天冬氨酸>苏氨酸,但在未成群蜂王体内由高到低依次为谷氨酸>亮氨酸>丙氨酸>天冬氨酸>丝氨酸>苏氨酸。

图1 熊蜂成群(A)与未成群(B)蜂王体内氨基酸组成Fig.1 Amino acids composition of bumblebee queens in colony foundation success (A) and colony foundation failure (B)

2.1.2氨基酸含量

对成群和未成群熊蜂蜂王体内氨基酸含量进行测定,结果见表1。成群与未成群阶段熊蜂蜂王体内13种氨基酸含量存在显著差异,分别为天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、络氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。在13种氨基酸中,除丙氨酸外,成群蜂王体内其他氨基酸的含量均显著低于未成群蜂王(P<0.05)。经过比较不同生理阶段熊蜂蜂王体内各氨基酸含量的差异幅度可发现,蜂王体内缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸的变化幅度最大,均高于14%。

表1 成群蜂王与未成群蜂王体内氨基酸含量比较

2.2 成群与未成群熊蜂蜂王体内脂肪酸差异

2.2.1脂肪酸组成

在待检测的35种脂肪酸中蜂王体内仅检测到17种脂肪酸,油酸C18∶1n9c、α-亚油酸C18∶3n3和亚油酸C18∶2n6c为蜂王占比最多的3种脂肪酸(图2)。脂肪酸根据碳氢链中饱和程度,可分为饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。在熊蜂成群蜂王体内SFA、MUFA和PUFA的占比分别为14.16%、36.50%和49.34%。而在未成群蜂王体内SFA、MUFA和PUFA的占比分别为17.91%、39.66%和42.43%。

2.2.2脂肪酸含量

成群和未成群熊蜂蜂王体内脂肪酸含量见表2。成群与未成群阶段熊蜂蜂王体内6种脂肪酸含量存在显著差异(P<0.05),分别为辛酸、癸酸、月桂酸、亚油酸、顺-11-二十烯酸、二十三酸。在6种脂肪酸中,未成群蜂王体内辛酸、癸酸、月桂酸的含量显著高于成群蜂王,而成群蜂王体内亚油酸、顺-11-二十烯酸、二十三酸显著高于未成群蜂王。经过比较不同蜂王体内饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量可发现,成群蜂王体内多不饱和脂肪酸含量显著高于未成群蜂王(P<0.05)。

3 结论与讨论

熊蜂属于亚社会性昆虫,其蜂王滞育结束后独自进行产卵和哺育幼虫,至第一批工蜂(数量为8～16头)羽化出房后,蜂王专职产卵,工蜂进行哺育和采集等活动(Goulson, 2009)。当蜂群内工蜂数量超过10头时,该蜂群进入成群阶段。成群意味着该蜂群完成了从独居性向社会性的转变,也是后续群势增长、子代繁衍以及为作物授粉的前提条件。到一定时间后群势仍未达到10头工蜂的蜂群通常定义为未成群,熊蜂工厂化繁育中未成群的原因通常是由于蜂王的产卵能力和哺育能力较低所导致的(徐凯等, 2020)。本研究比较成群和未成群蜂王体内氨基酸和脂肪酸组成,发现成群和未成群蜂王体内各氨基酸和脂肪酸含量占比均存在较大差异,推测蜂王体内氨基酸和脂肪酸的代谢参与了熊蜂产卵、哺育等生殖活动,与Ghosh等研究结果相近(Ghoshetal., 2017)。

图2 熊蜂成群(A)与未成群(B)蜂王体内脂肪酸组成Fig.2 Fatty acids composition of bumblebee queens in colony foundation success (A) and colony foundation failure (B)注:SFA,饱和脂肪酸;MUFA,单不饱和脂肪酸;PUFA,多不饱和脂肪酸。Note: SFA, Saturated fatty acids; MUFA, Monounsaturated fatty acids; PUFA, Polyunsaturated fatty acids.

表2 成群蜂王与未成群蜂王体内脂肪酸含量

氨基酸和脂肪酸分别作为蛋白质和脂质的基本组成单位,在昆虫生长发育、生殖繁衍以及适应环境等生理过程中发挥着重要作用(Simpsonetal., 2012; 龙登隆等, 2021)。已有研究表明,一些功能性氨基酸和脂肪酸会影响动物的性腺发育、精卵质量、胚胎发育等繁殖性能(Wu, 2009; Zakerietal., 2011)。Hoedjes等(2017)研究表明日粮中功能性氨基酸对果蝇的寿命和生殖能力有直接影响。李兴鹏等(2018)发现提高蠋蝽Armachinensis日粮中不饱和脂肪酸质量分数有助于4～5龄若虫生长,并提升其成虫的生殖能力。Ling等(2007)提高日粮中亚麻酸和亚油酸的质量分数后,果蝇的羽化率、产卵量和卵孵化率显著增加。本研究在熊蜂蜂王体内分别检测到16种氨基酸和17种脂肪酸,经比较后发现,在成群和未成群蜂王体内分别有13种氨基酸和6种脂肪酸含量存在显著差异,推测蜂王体内氨基酸和脂肪酸参与了熊蜂的成群过程,与上述研究结果相一致。

氨基酸是昆虫生长发育和繁殖所必须的营养元素,除了一些蚜虫等刺吸式口器的昆虫外,大多数昆虫均先将蛋白质水解为氨基酸后由虫体细胞吸收、循环,并再次合成肌肉、细胞膜、酶以及一些特殊的激素等需要的蛋白质(张杨等, 2021)。在果蝇的相关研究中发现,日粮中蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等必需氨基酸的添加能够有效延长果蝇的寿命,并提高其繁殖力(Hoedjesetal., 2017)。Ghosh等(2017)比较熊蜂Bombusterrestris滞育期体内氨基酸含量后发现,熊蜂滞育前后蜂王体内赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸的含量降低,其余氨基酸含量上调。本研究中发现,熊蜂成群和未成群蜂王体内13种氨基酸含量存在显著差异,且除丙氨酸外,其余氨基酸均为显著下降,且缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸下降幅度较大。李方方等(2013)研究表明,日粮中的缬氨酸与赖氨酸可提高初产母猪的日采食量和产仔性能。陈熠等(2009)研究表明缬氨酸对泌乳母猪体内激素水平具有一定影响。Wu等(2005)对妊娠不同时期的母猪及胎儿液检测后分析发现妊娠母猪体内脯氨酸含量与胎盘发育速度存在相关性。Kazuchika等(2014)研究发现甘氨酸对卵母细胞发育以及胚胎发育具有直接影响。成群蜂王体内缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸的大幅下降,推测熊蜂成群与蜂王采食量、卵母细胞发育、生殖激素分泌以及产卵性能密切相关。

脂肪酸是一类一端含有一个羧基的脂肪族碳氢链,参与昆虫生长发育、激素分泌、生殖和抗寒等多项生理活动(郑天祥等, 2017)。脂肪酸一般分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。研究表明,多不饱和脂肪酸通过合成类固醇激素进而影响动物的繁殖性能,不仅可以促进动物生殖器官的发育,还可以提高其排卵率和产仔率(王怀禹, 2011)。本研究中成群阶段蜂王体内多不饱和脂肪酸显著高于未成群蜂王,推测多不饱和脂肪酸在提高蜂王卵巢功能和促进产卵方面发挥着重要作用(Vrabliketal., 2013)。辛酸C8∶0、癸酸C10∶0和月桂酸C12∶0均属于中链脂肪酸,比长链脂肪酸更易被动物吸收,具有迅速供能作用。本研究发现成群蜂王体内辛酸、癸酸和月桂酸均显著低于未成群蜂王,推测在熊蜂成群过程中大量的中链脂肪酸被肠道所吸收,用以产卵和哺育幼虫时的部分能量来源(袁爱雲, 2021)。此外,中链脂肪酸还具有调节动物肠道形态、抑制有害菌增殖、调节免疫功能以及促进动物的生长性能等功能,蜂王体内中链脂肪酸的代谢也可增强蜂王免疫能力,利于熊蜂成群(Sundqvistetal., 2018)。吴洪号等(2021)研究表明ω-6(包含亚油酸)类脂肪酸能够调节生长激素和催乳素的分泌。Holman等(2019)对社会性昆虫蜂王信息素进行转录组分析后发现蜂王信息素合成相关基因富集于长链脂肪酸和不饱和脂肪酸合成的分子通路。此外,大量的研究也表明,长链脂肪酸也是蜂王物质表皮碳氢化合物CHCs的组成成分(Oldhametal., 2010)。本研究发现成群蜂王体内长链脂肪酸(C23∶0、C20∶1和C18∶2n6c)的含量显著高于未成群蜂王,推测该3种脂肪酸在蜂王成群后机体合成蜂王物质和信息素中发挥着重要作用。

本研究结果表明,熊蜂成群和未成群蜂王体内氨基酸和脂肪酸含量存在显著差异(P<0.05),熊蜂蜂王成群率低可能与蜂王体内蛋白质和脂类代谢异常有关。基于此研究结果,在实际的熊蜂工厂化繁育过程中,应挑选多种蛋白质含量高、富含多不饱和脂肪酸的新鲜蜂花粉混合后饲喂蜂群,并根据蜂群的不同繁育阶段调整蜂花粉种类配比,最大限度保证蜂王较高的繁殖性能,提高熊蜂成群率。