中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

李 强,刘 芳,赵红霞*,赵俊星*

(1. 山西农业大学动物科学学院,山西太谷 030801;2. 广东省科学院动物研究所,广东省动物保护与资源利用重点实验室,广东省野生动物保护与利用公共实验室,广州 510260)

昆虫是地球上物种最丰富的动物类群之一,与人类关系十分密切。在长期的进化过程中,昆虫与外界环境相互作用,形成了复杂且灵敏的化学感受系统(如嗅觉和味觉系统)。在参与昆虫嗅觉行为的多种蛋白中,有一类小分子量的亲水性转运蛋白—气味结合蛋白(Odorant binding proteins, OBPs)。这类蛋白存在于昆虫嗅觉感受器的淋巴液中,能够将外界疏水性的气味分子运输到嗅觉神经元树突状膜上,然后激活神经元树突状膜上的气味受体ORs(odorant receptors, ORs)实现信号转导,最终通过中枢神经系统产生行为反应(Lealetal., 2013; Pelosietal., 2018)。因此,从嗅觉发生的过程可以看出,OBPs在识别气味分子和引发昆虫生理反应的过程中起到了极其重要的作用(赵慧婷等,2020)。

自昆虫第一个OBP蛋白被Vogt等(1981)从多音天蚕蛾Antheraeapolyphemus触角中鉴定得到以来,已在鳞翅目(Sunetal., 2017a)、鞘翅目(Lietal., 2017)、双翅目(Zhaoetal., 2018)、膜翅目(Zhaoetal., 2016)、直翅目(Jiangetal., 2018)和半翅目(Sunetal., 2017b)等多类昆虫中鉴定获得了OBPs。Forêt和Maleszka(2006)在意大利蜜蜂Apismellifera基因组中共鉴定到21个OBPs,其中的9个基因在触角中特异性表达,其余基因在各个组织或特异的组织中表达。随后赵慧婷(2021)对21个OBPs在意大利蜂头部表达模式进行研究表明,13个OBPs在头部高表达,且大多数OBPs在4日龄表达量最高。目前在中华蜜蜂Apisceranacerana基因组中共鉴定到17个OBPs(Zhaoetal., 2016)。其中Weng(2015)发现AcerOBP1容易与蜂王信息素结合。Li(2020)发现AcerOBP2更容易与一般气味结合。除此之外,AcerOBP11还能与蜜蜂信息素和一些植物挥发物结合(Songetal., 2018)。最近研究表明,AcerOBP10参与氧化应激防御(Guoetal., 2021)。

中华蜜蜂Apisceranacerana作为中国特有的蜜蜂品种,具有嗅觉灵敏、采集力强、善于利用零星蜜源植物、抗逆抗病能力强等突出的优点,适合在中国的山林地区饲养(杜亚丽等,2016)。对中华蜜蜂OBPs的研究,不仅可以明确中华蜜蜂的嗅觉识别机制,还能够为科学饲养管理提供理论指导。目前对中华蜜蜂OBP4的研究报道较少,因此本研究通过分析AcerOBP4基因在中华蜜蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式及分子特性,为研究蜜蜂OBP4蛋白更广泛的生理功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 中华蜜蜂采集

供试蜜蜂均采自广东省科学院动物研究所广州综合试验站蜂场。从幼虫脾上采集正在哺育小幼虫的蜜蜂作为哺育蜂,只有将头伸进幼虫巢房至少10 s的蜜蜂才被认为是哺育蜂。在蜂巢门口采集后足携带花粉的蜜蜂作为采集蜂。最后从成熟的封盖子脾中采集刚出房的1日龄成年工蜂。蜜蜂的采样均来自3个蜂群,每个蜂群采集15头蜂。

解剖1日龄工蜂、哺育蜂和采集蜂,不同组织部位包括头、胸、腹、足、触角、脑。保存在-80℃。

1.2 RNA提取和cDNA合成

按照Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)说明书提取各样品的总RNA。经核酸测定仪检测RNA的浓度后,使用反转录试剂盒(AG,中国大连)进行cDNA合成。合成过程:①基因组DNA的去除。反应总体系为10 μL: 5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL,总RNA 500 ng,RNase Free ddH2O补足10 μL。反应程序:42℃孵育2 min;②反转录。反应总体系为20 μL: 5×Evo M-MLV RT Reaction Mix 4.0 μL,RNase Free ddH2O 6 μL步骤①的反应液10 μL。反应程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃,2 min。

1.3 引物设计

在NCBI数据库中搜索中华蜜蜂OBP4(序列号:AKQ98505)基因的核苷酸序列,采用Primer 5.0软件设计引物,用qRT-PCR实验。

1.4 AcerOBP4的生物信息学分析

在NCBI中用Blastn(http://blast. ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)工具进行氨基酸序列的同源性分析;ProtParam(http://web.expasy.org/cgi bin/protparam/protparam)预测蛋白的分子量、等电点等理化性质;ProtScale(http://web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl)进行疏水性分析;PSORT II(http://psort. hgc.jp/form2.html)和LocTree 3(https://rostlab.org/ services/loctree3/)进行亚细胞定位;将去除信号肽的氨基酸序列导入在线软件Swiss-Model(http://swissmodel. expasy.org/)三级结构的预测。利用DNAMAN软件进行氨基酸的多序列比对,采用MEGA 5.2软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树,Bootrap为1 000次。

1.5 荧光定量PCR反应

以各样品的cDNA(反转录之后进行4倍稀释)为模板,使用SYBR® Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行荧光定量PCR。反应体系(20 μL): SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL上下游引物(Acerobp4F: 5′TCGAAGCCTGCGTATT CCAA3′; Acerobp4R: 5′ GCAGCTTCGCTAATACA CTGC 3′)各0.8 μL,cDNA模板3 μL,DEPC水5.4 μL。反应条件:95℃预变性30 s;接着进行40个循环:95℃ 30 s,60℃ 30 s。测定熔解曲线的反应条件:以0.5℃的升温速度从60℃升至95℃。以β-actin为内参,每个样品进行2个技术重复。

1.6 数据处理

对于qPCR检测数据,根据扩增曲线获得的Ct值,采用2-ΔCT法进行数据分析。利用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析,Duncan法进行多重比较,并利用GraphPad Prism 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 AcerOBP4的分子特性

AcerOBP4蛋白分子式为C697H1099N177O219S11,预测分子量为15.81 kDa,理论等电点为4.57。在组成AcerOBP4蛋白的18种氨基酸中,谷氨酸(Glu)所占的比例最高,达到10.9%;带正电荷氨基酸总数(Arg+Lys)为15,带负电荷氨基酸总数(Asp+Glu)为16,表明该蛋白带负电荷;总平均疏水系数(GRAVY)为-0.167,不稳定系数为38.29,脂溶系数为91.88,说明该蛋白比较稳定。AcerOBP4的氨基酸序列中含有5个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-c OBP亚家族。

2.2 AcerOBP4的结构预测

NCBI在线结构域分析结果表明,AcerOBP4编码产物的第51-116位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族的保守结构区域PBP-GOBP superfamily(图1)。疏水性分析显示,AcerOBP4的氨基酸序列中,第48位氨基酸Score值最低为-2.733,第7、8位氨基酸最高为3.289;存在多个比较明显的疏水区域(Score为正值的区域),它们可能是脂溶性气味分子的结合位点。亚细胞定位结果表明,AcerOBP4蛋白可能存在于内质网(55.6%)、细胞核(11.1%)、高尔基体(11.1%),线粒体(11.1%)和细胞质(11.1%)中,主要集中在分泌途径上,说明该蛋白属于分泌型蛋白。以东方蜜蜂OBP4为模板对其三维结构进行预测(图2),结构相似性为24.5%,无跨膜螺旋(number of predicted TMHs=0)。

图1 AcerOBP4的保守结构区域预测Fig.1 Prediction of AcerOBP4’s conservative structure

2.3 AcerOBP4的氨基酸序列比对和系统进化分析

在NCBI核酸数据库将AcerOBP4进行BlastX分析,找到与目的基因有同源性的其他昆虫的氨基酸序列。序列比对结果显示。中华蜜蜂AcerOBP4与意大利蜜蜂AmelOBP4的氨基酸序列一致性最高(图3),达到78%。使用MEGA 5.2软件邻位相连法进行1 000次重复计算后构建系统进化树。所有选用的昆虫OBPs形成两个大的分支(图4):中华蜜蜂AcerOBP4、西方蜜蜂AmelOBP4、松树蜂SirexnoctilioFabricius OBP12、三叶蜂TrissolcusjaponicusOBP3、胡蜂DiachasmaalloeumOBP69a、桑蝗聚瘤姬蜂GregopimplakuwanaeOBP7、布氏游蚁EcitonburchelliOBP7聚为一个分支,其中AcerOBP4与AmelOBP4亲缘关系最近;角壁蜂OsmiacornutaOBP1和草履蚧Drosichacorpulenta(Kuwana) OBP15聚为另一分支。

图2 AcerOBP4的蛋白质三维结构预测模型Fig.2 Three-dimensional prediction structure of AcerOBP4 established by Swiss-Model

图3 中华蜜蜂AcerOBP4与其他昆虫气味结合蛋白氨基酸序列比对Fig.3 Amino acid sequence alignments of AcerOBP4 with the known OBPs from other insects注:保守半胱氨酸位点用黄色方框标注Conversed cysteine residues were boxed in yellow. OBP蛋白来源及GenBank登录号Origin of OBP proteins and their GenBank accession numbers: AmelOBP4, 意大利蜂Apis mellifera(NP_001011589.1); AcerOBP4, 中华蜜蜂Apis cerana cerana(AAR83081); OcorOBP1, 角蜜蜂Osmia cornuta(AGI05200); DcorOBP15, 草履驮Drosicha corpulenta(ALV87608); EburOBP7,布氏游蚁 Eciton burchellii(KAH0950003); SnocOBP12, 松树蜂Sirex noctilio(QHN69053); TjapOBP3, 三叶蜂Trissolcus japonicus(QNC49768); GkuwOBP7, 柔蝗聚瘤姬蜂Gregopimpla kuwanae(UEN71172); DalOBP69a, 胡蜂Diachasma alloeum(XP_015125081)。

图4 基于氨基酸序列构建的OBPs系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of OBPs based on amino acid sequence

2.4 AcerOBP4 mRNA时空表达分析

通过实时荧光定量PCR技术分析AcerOBP4mRNA在1日龄工蜂、采集蜂、哺育蜂不同组织中mRNA的表达差异,研究结果发现,AcerOBP4在中华蜜蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足中均有表达,但其表达程度有差异(图5～图7)。1日龄工蜂触角和足的表达量,均极显著高于其他组织(P<0.01),而头、胸、腹、脑的表达量没有差异(P>0.05)。哺育蜂触角中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),而足中表达量极显著高于头、胸、腹、脑部(P<0.01)。采集蜂触角中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),足中的表达量也显著高于触角之外的其他组织(P<0.01),胸部表达量最低。

图5 AcerOBP4在1日龄中华蜜蜂不同组织中的表达量Fig.5 Expression profiles of AcerOBP4 in different tissues from one-day bees of Apis cerana cerana

图6 AcerOBP4在中华蜜蜂哺育蜂不同组织中的表达量Fig.6 Expression profiles of AcerOBP4 in different tissues of nurse Apis cerana cerana

图7 AcerOBP4在中华蜜蜂采集蜂不同组织中的表达量Fig.7 Expression profiles of AcerOBP4 in different tissues of forager Apis cerana cerana

3 结论与讨论

本研究通过生物信息学分析了中华蜜蜂AcerOBP4基因序列,该基因编码138个氨基酸,分子量为15.81 kDa,序列中含有保守的半胱氨酸位点,AcerOBP4只有5个保守的Cys位点,属于Minus-C OBP亚家族。氨基酸同源序列和系统进化树分析表明,AcerOBP4与意大利蜜蜂AmelOBP14同源性较高,推测它们是直系同源基因。通过对AcerOBP4mRNA的时空表达分析,本研究发现在1日龄工蜂、哺育蜂、采集蜂3个发育阶段,触角中OBP4的表达量在任一发育阶段都显著高于其他组织,此外,足中的OBP4是除了触角之外表达量最高的。

有研究已证实,在昆虫触角中高表达的OBPs主要行使嗅觉功能(Lealetal.,2013; Qiuetal.,2018),如多音天蚕蛾AntheraeapolyphemusApolPBPs(Vogt and Riddiford,1981)。斜纹夜蛾SpodopteralituraSlitGOBP(吴仲南等,2009)、中华按蚊AnophelessinensisAsinOBP1(秦赠等,2015)、桃蛀螟ConogethespunctiferalisCpunPBP1(贾小俭等,2015)也是在触角中特异性高表达。本研究发现AcerOBP4在中华蜜蜂各组织中均有表达,但在触角中表达量相对较高,作为社会性昆虫,蜜蜂必须依赖其复杂的嗅觉系统来调节蜂巢内外的一切活动,如哺育幼虫和蜂王、识别同伴和寻找蜜粉源植物等。触角是蜜蜂最主要的嗅觉感受器官,其上分布着大量感器,而OBP4在不同日龄工蜂触角的表达量是有变化的,暗示该基因在蜜蜂的嗅觉调控过程中发挥一定的作用。Forêt(2006)分析了西方蜜蜂OBPs在幼虫、蛹、1日龄幼蜂和采集蜂的表达量,结果显示采集蜂,工蜂和蜂王的触角中AmelOBP4都存在高表达,并且在新出房蜜蜂的足中也有表达,与本研究发现相同,推测中华蜜蜂的足也参与了蜜蜂的嗅觉行为。

本研究结果表明AcerOBP4主要在触角中表达,并且在足中也有表达,推测AcerOBP4主要参与中华蜜蜂的嗅觉行为,为了进一步研究AcerOBP4的作用,需要继续对其生物学功能进行深入研究。最后AcerOBP4在足中的表达量仅次于在触角中的表达量,表明足可能也参与了中华蜜蜂的嗅觉行为,这需要进一步研究。