LncRNA LUCAT1促进宫颈癌SiHa细胞的增殖、转移及顺铂耐药*

魏 丽,陈玉忠,杜 军,李 艳,张慧慧,李多杰

(1.蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科,安徽 蚌埠 233000;2.肿瘤外科;3.放疗科)

宫颈癌(cervical cancer, CC)是全球第四大常见的癌症,也是女性癌症死亡的主要原因[1],严重威胁着女性的身心健康。目前对于宫颈癌的治疗主要包括手术治疗、放疗与化疗,同时化疗是目前临床延长晚期宫颈癌患者生命的主要策略[2]。顺铂作为一种常用的化疗药物,可以导致严重的DNA损伤,引发癌细胞死亡。在临床初期治疗时具有良好的治疗效果,但是大多数宫颈癌患者无可避免地发展成了顺铂耐药,严重阻碍了顺铂的疗效[3-4]。因此,深入探讨研究宫颈癌的顺铂耐药机制将为提高宫颈癌化疗效果提供理论依据,具有重要的现实意义。

长链非编码 RNA是一类转录本长度超过 200个核苷酸的新型非编码RNA,其不具备编码蛋白质的能力[5]。随着研究的深入,越来越多的lncRNA被发现在肿瘤组织中异常表达。LncLUCAT1即肺癌相关转录产物1,在多种肿瘤中均显著高表达[6-8]。但是对于LncLUCAT1在宫颈癌细胞增殖和转移,以及顺铂(cis-dichlorodiamineplatinum, DDP)耐药中的作用及潜在的调控机制尚无明确的报道。本文章探究LncLUCAT1在宫颈癌细胞增殖转移以及顺铂耐药中的作用及潜在机制,以期为明确LncLUCAT1在宫颈癌发生发展的作用及机制,以及提高顺铂临床化疗效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要材料 宫颈癌SiHa细胞购于北纳生物;RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司;MTT购自biosharp公司;Lip2000转染试剂购自Invitrogen公司;qPCR试剂盒购自TAKARA公司;蛋白激酶 B( protein kinase B,AKT) 、磷酸化的 AKT( phospho-AKT,p-AKT)抗体,购自CST公司;pcDNA3.1载体、pcDNA3.1-LncLUCAT1载体、LUCATI小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)(LncLUCAT1 siRNA-1与LncLUCAT1 siRNA-2)和阴性对照siRNA购自中国上海GenePharma公司;荧光定量PCR仪购自美国ABI 公司;NanoDrop One/One C微量核酸蛋白浓度测定仪购于美国Thermo公司;Synergy-HT酶标仪购自美国Bio Tek公司;Fusion FX Spectra凝胶成像系统购自法国Vilber公司。

1.2细胞培养及转染 宫颈癌SiHa与SiHa/DDP细胞培养于含有10 %胎牛血清RPMI-1640培养基中,放置于37 ℃、5 %CO2的培养箱中,待细胞汇合度达到80 %时,使用胰酶消化传代。细胞干扰实验分为阴性对照组(NC)与LncLUCAT1 siRNA组(LncLUCAT1 siR-1和LncLUCAT1 siR-2)。细胞过表达实验分为vector组与LncLUCAT1-OE组。当细胞汇合度至60 %～70 %时,使用Lip2000转染适量的siRNA和载体至SiHa/DDP细胞中,细胞置于培养箱继续孵育48 h。

1.3荧光定量PCR实验 收取分组处理后的细胞,使用Trizol试剂提取总RNA,使用核酸定量仪检测RNA含量,利用逆转录试剂盒合成cDNA,混合2 μL cDNA模板与各0.4 μL的上下游引物和10 μL的Mix以及7.2 μL ddH2O,总反应体系为20 μL,然后设置PCR程序,95 ℃预变性持续5 min;95 ℃预变性持续10 s;60 ℃退火、持续30 s,总共循环40次,上机进行qPCR反应,以GAPDH为内参,反应后利用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 LncLUCAT1、GAPDH引物序列

1.4MTT实验 将转染后的SiHa/DDP细胞接种于96孔板中,5×103/孔,置于培养箱24 h后,细胞分为对照组与给药组,分别将0、5、10、20、40、80、160 μg/mL的DDP加入到对应细胞中,于培养箱中孵育48 h,MTT法检测细胞存活率,每孔添加15 μL MTT溶液并置于37 ℃环境中孵育30 min,弃掉孔中上清液体并加入150 μL DMSO溶液,酶标仪检测吸光度值(490 nm),DDP半数抑制浓度(IC50)为抑制50 %细胞生存能力所需的DDP浓度。使用GraphPad软件计算DDP IC50值。

1.5集落克隆实验 细胞按照1.5×103/孔的密度接种于6孔板中,根据实验分组处理后置于37 ℃培养箱约12 d后弃掉培养基,PBS洗涤两次,室温下加入4 %的多聚甲醛1 mL,静置10 min,弃掉多聚甲醛后加入结晶紫染色30 min,双蒸水洗净结晶紫溶液后,观察并拍照、计数以及分析处理。

1.6Transwell实验 Transwell小室使用基质胶包被(迁移实验无需此操作),离心消化细胞并调整细胞密度,在上室中加入无血清的细胞悬液,下室中加入含有血清的完全培养基,将细胞置于培养箱中培养48 h,取出小室并清洗后,使用棉签擦掉上室中无迁移/侵袭的细胞,下室表面细胞用 0.5 %结晶紫染色30 min,在显微镜下随机选取视野拍照,后续进行统计分析。

1.7Western blot检测相关蛋白表达 取生长对数期5×105个细胞接种于60 mm皿中,分别进行转染处理,48 h后收取各组细胞,使用RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min,置于离心机中12 000 r/mim、4 ℃离心30 min,取上清总蛋白并进行定量,加入蛋白上样缓冲液后加热变性,然后取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳,转移至聚偏二氟乙烯膜上,使用5 %的脱脂牛奶封闭2 h,与稀释后的一抗在4 ℃环境孵育过夜,TPBS洗涤3次,二抗孵育2 h,TPBS洗膜后使用ECL试剂盒发光显影,凝胶成像仪获取蛋白图像,用 Image J 软件对曝光结果进行定量分析。

2 结果

2.1LncLUCAT1在宫颈癌组织中高表达 实时定量PCR技术检测30例宫颈癌和相匹配的正常组织中LncLUCAT1的表达情况,结果显示宫颈癌组织中LncLUCAT1的表达高于相匹配的正常组织(P<0.05),表明LncLUCAT1 在宫颈癌组织中表达上调。见图1。

图1 qPCR检测LncLUCAT1的表达水平

2.2下调LncLUCAT1表达抑制宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和转移 LncLUCAT1 siRNA敲低LncLUCAT1表达后,MTT与集落克隆检测SiHa细胞增殖能力变化,Transwell检测细胞侵袭迁移能力变化。结果显示与NC对照组相比,siRNA(siR-1和siR-2)可以明显干扰LncLUCAT1(P<0.05)的表达,干扰LncLUCAT1表达后,SiHa细胞的增殖能力显著降低(P<0.01),克隆形成能力显著下降,同时与NC对照组相比,干扰组的侵袭和迁移细胞数目减少。以上结果表明,下调LncLUCAT1表达后,SiHa细胞的增殖、侵袭和转移能力均显著降低。见图2。

图2 下调LncLUCAT1表达对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和转移的影响

2.3LncLUCAT1在SiHa/DDP细胞中表达上调 为研究LncLUCAT1 在宫颈癌细胞SiHa顺铂(DDP)耐药中的作用机制,本研究通过被动增加顺铂(DDP)剂量刺激建立顺铂耐受SiHa细胞株SiHa/DPP,采用实时定量PCR技术检测SiHa/DPP中LncLUCAT1的表达情况,结果显示与正常SiHa细胞相比,SiHa/DPP中LncLUCAT1表达显著上调(P<0.01)。见图3。

2.4SiHa/DDP细胞中LncLUCAT1过表达与敲低效果验证 LncLUCAT1 siRNA与LncLUCAT1-OE分别转染BGC823细胞48 h后,qPCR检测LncLUCAT1表达情况。结果显示,与NC对照组相比,LncLUCAT1干扰组SiHa/DDP细胞中LncLUCAT1表达水平显著降低(P<0.05),与vector组相比,LncLUCAT1-OE组SiHa/DDP细胞中LncLUCAT1表

图3 qPCR检测SiHa细胞顺铂(DDP)耐受后LncLUCAT1变化

达水平显著升高(P<0.05),以上结果表明LncLUCAT1 siRNA可以显著干扰LncLUCAT1表达以及LncLUCAT1-OE可以显著增加LncLUCAT1的表达。见图4。

图4 SiHa/DDP中干扰与过表达LncLUCAT1表达

2.5干扰与过表达LncLUCAT1对SiHa/DDP细胞DDP IC50的影响 NC组与LncLUCAT1-KD (siR-1)组SiHa/DDP细胞DDP IC50分别为(34.9±5.18)和(21.59±1.91)μg/mL,差异具有统计学意义(P<0.05),vector组与LncLUCAT1-OE组SiHa/DDP细胞DDP IC50分别为(35.2±6.30)μg/mL和(49.23±5.11)μg/mL,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明干扰LncLUCAT1表达降低了SiHa/DDP细胞的DDP IC50值,而过表达LncLUCAT1增加了SiHa/DDP细胞的DDP IC50值。见图5。

图5 干扰与过表达LncLUCAT1对SiHa/DDP细胞DDP IC50的影响

2.6干扰与过表达LncLUCAT1对SiHa/DDP细胞中AKT蛋白的影响 SiHa/DDP细胞中,与NC组相比,LncLUCAT1-KD组p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05),与vector组相比,LncLUCAT1-OE组p-AKT蛋白表达显著升高(P<0.05)。结果表明干扰LncLUCAT1表达抑制SiHa/DDP细胞磷酸化AKT蛋白的表达,而过表达LncLUCAT1增强了SiHa/DDP细胞磷酸化AKT蛋白的表达。见图6。

图6 干扰与过表达LncLUCAT1对SiHa/DDP细胞中AKT蛋白的影响

3 讨论

大量的lncRNA被发现在肿瘤中出现异常表达,并作为肿瘤致癌基因或者肿瘤抑制因子发挥重要作用。研究报道,lncRNAs参与多种生理以及病理过程,包括一些细胞的生长增殖,侵袭迁移,凋亡和耐药等[9-10]。LncLUCAT1基因定位于人体5号染色体长臂1区4带(5q14.3),存在6个外显子,全长890 nt。

Sun等[11]研究发现LncLUCAT1与肺癌患者较差的临床预后相关,并通过抑制p21和p57基因表达来调节肺癌细胞增殖。在卵巢癌中,Yu等[12]研究发现, LncLUCAT1表达上调,且与肿瘤患者的生存率呈负相关。在卵巢癌细胞中沉默 LncLUCAT1表达后,细胞增殖、迁移和侵袭能力均减弱,但凋亡水平增加。进一步的研究证实,LncLUCAT1可以通过miR-612/HOXA13调控轴促进卵巢癌的发生发展[12]。胰腺癌中,过表达LncLUCAT1会导致细胞增殖及侵袭迁移能力增加,而干扰LncLUCAT1后则减弱了细胞的增殖及侵袭能力,细胞凋亡增加以及影响细胞周期,导致G0/G1期细胞增多[13]。在本研究中发现下调LncLUCAT1可以抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖,侵袭和迁移。以上研究表明LncLUCAT1在宫颈癌等肿瘤中的发生发展发挥重要作用。

当前,由于化疗药物的使用普遍导致肿瘤细胞耐药,严重降低了宫颈癌患者的临床疗效,因此,探究宫颈癌对DDP的耐药机制是必要的。目前已有研究发现一些lncRNAs在包括宫颈癌在内的多种肿瘤对DDP耐药中具有重要的调控作用,例如LncRNA PCAT-1调控STAT3与PTEN表达降低宫颈癌细胞对顺铂的敏感度[14],而 LncLUCAT1在宫颈癌细胞DDP耐药中的作用机制尚不清楚。在本研究中使用DDP逐级刺激SiHa细胞产生耐药,发现LncLUCAT1在SiHa/DDP细胞中表达上调,同时干扰LncLUCAT1的表达可增加SiHa/DDP细胞对DDP的敏感度,而过表达LncLUCAT1可降低SiHa/DDP细胞对DDP的敏感度。同时进一步实验发现,过表达LncLUCAT1增强了SiHa/DDP细胞磷酸化AKT蛋白的表达,而干扰LncLUCAT1表达抑制SiHa/DDP细胞磷酸化AKT蛋白的表达,以上结果表明LncLUCAT1可以调控磷酸化AKT蛋白的表达。AKT是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,也被称为蛋白激酶B (PKB)。AKT通路影响着肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭迁移,细胞蛋白质的合成以及自噬和凋亡等多种生理活动,同时在肿瘤细胞对化疗药物的耐药过程中也发挥着重要作用[15-18]。已有研究表明RAC3可以通过激活AKT信号途径促进宫颈癌对顺铂耐药[19]。而本研究发现宫颈癌SiHa细胞对DDP的耐药机制可能与LncLUCAT1调控的AKT磷酸化表达有关。

综上所述,研究结果表明LncLUCAT1可以影响宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭和迁移,同时在SiHa/DDP细胞中表达上调,并降低细胞对DDP的敏感度,其机制可能与调控AKT的磷酸化表达有关。然而其更深层次的分子机制及体内研究仍需进一步探讨,以期完善宫颈癌的发病机制,也为提高顺铂临床化疗效果提供理论依据。