基于组学方法的蒺藜炮制前后药效成分变化分析

宝紫荆，王曦烨，席海山，许 良

（1.内蒙古民族大学 化学与材料学院，内蒙古通辽 028043；2.天然产物化学及功能分子合成自治区重点实验室，内蒙古 通辽 028043；3.内蒙古民族大学 医学院，内蒙古 通辽 028043）

蒺藜为蒺藜科植物蒺藜（Tribulus terrestrisL·）的干燥成熟果实。性苦、味辛、平，具有平肝、疏肝、祛风名目、散风止痒之功效，常用于治肝阳上亢之头昏目眩、风热目赤翳障、风疹瘙痒等症状[1］。对于蒺藜化学成分的研究表明，其主要含有皂甙类、黄酮类、生物碱、多糖类化合物，其他还包含甾醇类、氨基酸类、萜类、脂肪酸、无机盐等成分[2］。据报道，作为蒺藜中的主要成分，目前，从蒺藜中共分离得到108种甾体皂苷[3］，其药理学表明，皂苷对于抗炎[4］、抗肿瘤[5］、心脑血管疾病[6-7］、利尿及性功能[8］均有一定作用。净蒺藜有毒，而中药炮制理论认为药材经过适当的炮制后可达到减毒增效的作用，因此，临床上用于入药的多为炒制后的蒺藜。炒制品蒺藜炮制方法为取净蒺藜，炒至微黄色，碾去刺即可。蒺藜作为民间药材历史悠久，从记录中最早的《五十二病房》中治疗蝎螫伤到如今与其他药材配伍用于治疗眼疾、胸痹、通身浮肿等多种疾病，蒺藜发挥了其重要的药用价值[9］。目前，对于蒺藜炮制后其药效成分的变化报道较少，本实验以净、炒熟蒺藜为研究对象，通过UHPLC-MS 结合组学方法分析蒺藜炮制前后化学成分含量的变化，探讨蒺藜炮制对其发挥药效的机理。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UHPLC-QE Focus orbitrap 液质联用仪（Thermo Fisher公司，USA）；FW177中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；甲醇、甲酸为色谱纯试剂（Thermo Fisher公司，USA）；水为超纯水（Millipore Corp，USA）。

净蒺藜与炒蒺藜均购于河北美康药业公司。所有中药饮片均由内蒙古民族大学化学与材料学院许良鉴定。

1.2 供试品溶液的制备

取净蒺藜与炒蒺藜，分别放置于FW177中草药粉碎机中粉碎，过40目筛，得到净蒺藜与炒蒺藜样品粉末。分别称取净蒺藜与炒蒺藜粉末样品各1 g，以95%乙醇回流3 h，抽滤后回收提取液，取提取液10 mL溶液定容至100 mL容量瓶中。量取1 mL溶液，吹干溶剂，加入1 mL甲醇后过0.45 μm微孔滤膜过滤，冷藏待测。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity BEH C18 柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；流动相为含0.1%甲酸水溶液。二元线性梯度洗脱：0~0.5 min，2%甲醇；0.5~7.0 min，2%~95%甲醇；7~8 min，95%甲醇；8.0~8.1 min，95%~2%甲醇；8.1~10.0 min，2%甲醇；进样量10 μL。

质谱条件：ESI 离子源，采用正离子模式，扫描范围：m/z 100～1 000，毛细管电压3 000 V，毛细管温度：320 ℃，蒸发温度：350 ℃。

1.4 数据处理

峰检测、峰对齐、归一化由Compound Discoverer software 2.0（CD2.0）软件来完成，并进行PCA、火山图分析。通过与METLIN等精确质量检索数据库进行比对，筛选出最有可能的化学标记物。

2 结果与分析

2.1 UHPLC-MS图谱分析

净蒺藜与炒蒺藜的总离子流色谱图见图1。由图1可知，2幅图对应位置的很多峰面积明显不同，说明蒺藜化学成分经炮制后发生了显著变化，而这些发生变化的成分需要借助高级统计学方法才能得以鉴定。

图1 净蒺藜与炒蒺藜的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion flow chromatograms of Tribulus terrestris and stir-fried Tribulus terrestris

2.2 PCA与火山图分析

PCA（主成分分析）是一种无监督的降维识别模式，即从原始变量中导出少数几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关，反映了不同变量间的差异。将净蒺藜与炒蒺藜的样品进行PCA分析，结果见图2（A）。由图2（A）可知，炮制前后的净蒺藜与炒蒺藜样本间明显分离，表明样本炮制后多种成分的含量发生了显著变化。火山图可以方便直观地展示2个样本间成分差异表达的分布情况，差异分布大的成分分布在两侧，所以左上端与右上端的数据点更具有研究意义，见图2（B）阴影部分。图2（B）中设定阈值P>0.05，且含量变化在2倍以上的点存在具有统计学差异，其中，左侧阴影部分为蒺藜炮制后含量减少的成分，右侧阴影部分为炮制后含量增加的成分。

图2 净蒺藜与炒蒺藜主成分分析图和火山图Fig. 2 Principal component analysis diagram and volcano map of Tribulus terrestris and stir-fried Tribulas terrestris

2.3 蒺藜炮制前后化学标记物的分析

通过PCA与火山图将具有统计学意义的化合物筛选出来，比对UHPLC-MS法测出来的质谱数据和METLIN等精确质量检索数据库中蒺藜化学成分的分子量，并分析鉴定，共得到8种化学标记物，分别为青地霉酸（terrestric acid）、丁二酸（succinic acid）、异鼠李素（isorhamnetin）、苜蓿素（tricin）、吉托皂苷元（Gitogenin）、替告皂苷元（tigogenin）、地索苷（trillin）、酵母甾醇（zymostrol），其中，青地霉酸、吉托皂苷元经炮制后含量有所下降，而替告皂苷元、丁二酸、异鼠李素、苜蓿素、地索苷、酵母甾醇经炮制后含量增加。表1为净蒺藜与炒蒺藜间化学标记物的信息。

表1 净蒺藜与炒蒺藜间的化学标记物信息Tab. 1 Chemical marker information between Tribulus terrestris and stir-fried Tribulus terrestris

3 讨论

蒺藜经过炮制后，皂苷类成分中的替告皂苷元和黄酮类成分中异鼠李素、苜蓿素的含量增加。据相关报道，胆固醇偏高会对肝功能造成一定伤害，替告皂苷元通过抑制FXR（farnesoid X receptor）的激活，导致胆固醇转化为胆汁酸的速率增加，改善胆固醇稳态，进而减少对肝功能的损伤[10］。替告皂苷元是螺甾烷醇的衍生物，是合成甾体激素类药物的医药中间体和重要原料，甾体皂苷在防治心脑血管疾病、抗肿瘤、降血糖等方面有显著疗效[11］；异鼠李素影响P38/PPAR-α通路，进而调控细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达，降低血清肝酶和促炎细胞因子水平，揭示了异鼠李素可能是未来治疗急性暴发性肝炎的一种潜在药物[12］；苜蓿素具有广泛的生物活性，抗炎作用明显，主要通过抑制环氧酶、肿瘤坏死因子、前列腺素、白细胞介素、一氧化氮等炎症介质发挥抗炎作用[13］。因此，炒蒺藜中替告皂苷元等有效成分含量的增加使药物对于肝病的疗效明显增强。中药炮制前后药效物质的改变是引起炮制品药性和功效改变的根本所在。因此，研究中药炮制前后化学成分性质和含量的变化是中药炮制对药效变化研究的重要内容[14］。蒺藜炮制后其化学标记物的含量变化，表明了蒺藜经炮制后由于其有效成分含量的增加而增强了药效。

4 结论

笔者以净、炒蒺藜为研究对象，通过UHPLC-MS结合组学方法分析蒺藜炮制前后化学成分含量的变化，探讨蒺藜炮制后对其药效增强的原因。研究发现，炮制后替告皂苷元、丁二酸、异鼠李素、苜蓿素、地索苷、酵母甾醇含量增加，说明这些化学成分的变化可能是其治疗肝炎、炎症、心血管等疾病疗效增强的原因。该研究为蒺藜的炮制原理的解析及其临床应用提供了实验依据。