某海水功能饮品中常量离子对脂肪酶的影响

马敬环，王步月，刘 莹，高 然

（1.天津工业大学环境科学与工程学院，天津 300387；2.天津海源汇科技有限公司，天津 300359）

海水作为生命的起源，富含90 多种无机盐、矿物质及微量元素[1]。合理开发和利用海水资源是实现可持续发展的重要措施。随着合理开发海水资源的深入，海水淡化不仅可解决全球水资源紧缺的问题，也可作为天然的“元素补充剂”，海水中的矿物质元素可调节人体内环境的元素平衡、调整电解质平衡、增强机体免疫力[2]，从而可有效预防慢性亚健康疾病的产生。因此，海水资源化成为当前的研究热点。

Nakagaw 等[3]证明海水做成矿物质元素饮品是安全的，可以作为优质的元素补给源，且由于其特性与生物活性（容易吸收、天然无污染）在多方面对人体有益，故海水可以加工成为功能性饮品。目前已有研究通过动物实验从医学角度证明：海水有助于预防高胆固醇血症、动脉粥样硬化[4]和轻度高血压[5]，且在改善皮炎症状[6]、降低总甘油三酯、提高高密度胆固醇脂蛋白和调节肝脂代谢功能[7]等方面有较好效果。从生物化学角度来讲，矿物质元素作为生命体所必需7 大营养素之一，参与了多种蛋白质的合成、分泌，甚至影响酶活性及机体代谢。海水中所含的离子可影响酶分子的构象[8]，从而影响其功能与活力；离子在酶促反应中常作为辅助因子参与反应，不同离子以不同方式与酶分子结合参与后续催化反应[9]。Lu 等[10]研究证明金属离子可以提高脂肪酶的稳定性和水解活性。更有研究[11]证实，在Mg2+离子、Na+离子等存在下脂肪酶的酶活力及稳定性均有所提升。

天津某公司以海水为原料生产的饮品，在推广应用过程中表现出具有一定的降脂功能。该饮品中含有23 种元素，本文针对该饮品所含常量离子（Mg2+、Ca2+、Na+、K+和B3+）进行研究，通过考察这5 种离子对脂肪酶活力、Zeta 电位、紫外和荧光特性的影响，探讨该饮品及其所含5 种离子对脂肪酶的作用机理，以期为该海水功能饮品的功能强化改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

材料：海水功能饮品，天津海源汇科技有限公司产品，其元素组成如表1 所示；猪胰脂肪酶，南京独莱生物技术有限公司产品；橄榄油、磷酸盐缓冲液、聚乙烯醇，均为上海麦克林生化科技有限公司产品；NaOH，分析纯，阿拉丁试剂公司上海分公司产品；无水乙醇、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、H3BO3，均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司产品。

表1 海水功能饮品元素组成Tab.1 Elements of marine functional drinks

仪器：SB-5200-DTDN 型超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司产品；SHZ-D 型循环水式多用真空泵，郑州博科仪器设备有限公司产品；HJ-6C 型恒温磁力搅拌水浴锅，金坛市科普实验仪器厂产品；FSH-2A 型可调高速匀浆机，常州市白塔安瑞实验仪器厂产品；Malvern Nano ZS90 型纳米粒径及电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司产品；GENESYS 10S 型紫外-可见分光光度计，美国赛默飞世尔科技有限公司产品；F-380 型荧光分光光度计，天津港东科技股份有限公司产品。

1.2 脂肪酶活力的测定

酶活力测定方法[12]参照国标GB/T 23535-2009 进行。通过测量脂肪酶催化油脂水解产生脂肪酸的含量来表征脂肪酶的催化活力。空白组（未加离子）酶活力为100%。某公司海水功能饮品为浓缩液，需稀释100倍后饮用。饮用时饮品中Mg2+、Ca2+、Na+、K+和B3+离子的浓度分别为8.83、0.04、2.52、0.73 和0.07 mmol/L。参照该饮品中5 种离子的浓度，分别配制不同浓度离子溶液。取适量酶粉溶于5 mL 磷酸盐缓冲液中，与不同浓度等量的离子溶液混合均匀。空白组加入等量纯水，而样品组酶液离子浓度分别为：Mg2+组2.00、4.00、6.00、8.00、8.83、10.00、12.00 mmol/L；Ca2+组0.02、0.04、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mmol/L；Na+组1.00、2.00、2.52、3.00、4.00、5.00、6.00 mmol/L；K+组0.50、0.73、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mmol/L。B3+组0.03、0.07、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mmol/L；海水功能饮品组浓度为海水功能饮品原液的1/100。于40 ℃、200 r/min的条件下在恒温振荡摇床中培育15 min 得到样品酶液，测定酶活力。空白组（未加离子）的酶活力为100%，计算样品组的相对酶活力，进行比较分析。

1.3 脂肪酶活力稳定性的测定

脂肪酶活力随着时间的推移而出现减弱的现象称为脂肪酶活力的稳定性。本文通过于15 min 和30 min 培育时间节点测定其酶活力，来表征脂肪酶活力稳定性。样品酶液均于40 ℃、200 r/min 的条件下在恒温振荡摇床中培育，分别在15、30 min 时取出1 mL样品酶液测量其酶活力。将空白组培育15 min 后的酶活力设定为100%，计算样品组的相对酶活力。

1.4 脂肪酶Zeta 电位的测定

Zeta 电位的变化可用来考察酶分子的分散机制和酶分子构象的改变[13]。于室温条件下将适量样品酶液加入样品室中，注意检查室内无小气泡后，采用Malvern Nano ZS90 型纳米粒径及电位分析仪测定Zeta 电位。

1.5 脂肪酶紫外吸收光谱的测定

通过测量紫外吸光度强度及峰位变化，表征海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶紫外光谱特性的影响。取0.1 g 酶粉溶于纯水，定容至100 mL，酶液用不同浓度的Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+离子溶液和海水功能饮品溶液在室温下处理成样品酶溶液。取适量样品酶溶液于比色皿中，使用GENESYS 10S 型紫外-可见分光光度计于室温下扫描，波段为190～350 nm。

1.6 脂肪酶荧光发射光谱的测定

通过研究荧光强度及其峰位置的变化程度，考察海水功能饮品及其5 种离子对蛋白质分子微环境及构象的影响[14]。使用F-380 型荧光分光光度计测定酶液荧光光谱，所用样品配制与紫外光谱中相同。测量参数设置为：激发光300 nm，发射光从280～500 nm 扫描，狭缝宽度10/10，PMT Voltage 950，扫描速率1 200 nm/min。

2 结果与讨论

2.1 对脂肪酶活力的影响

海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶活力的影响如图1 所示。

图1 海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶活力的影响Fig.1 Effect of marine functional drinks and its five ions on lipase activity

由图1 可知，Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+离子组均表现出对脂肪酶活力的促进效果，且与离子浓度呈正相关。Mg2+离子在浓度为8.83 mmol/L 时相对酶活力为129.95%；Ca2+离子在浓度为0.04 mmol/L 时相对酶活力为102.40%；Na+离子在浓度为2.52 mmol/L 时相对酶活力为121.51%；K+离子在浓度为0.73 mmol/L 时相对酶活力为117.95%；B3+离子在浓度为0.07 mmol/L 时相对酶活力为107.94%；稀释100 倍的海水功能饮品对酶催化活力的促进作用最为显著，相对酶活力为149.19%。由于海水功能饮品中含有多种离子，其种类与浓度的不同对酶的空间结构和功能所起的作用方式也不尽相同[15]。多种离子可通过影响脂肪酶的活性中心、或者改变环境极性使酶的构象发生改变[16]，促使酶活力显著提升，因而表现为相对酶活力最强。

2.2 对脂肪酶活力稳定性的影响

海水功能饮品及5 种常量离子对脂肪酶稳定性的影响如表2 所示。

表2 海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶稳定性的影响Tab.2 Effect of marine functional drinks and its five ions on stability of lipase

由表2 可知：空白组脂肪酶培育15 min 后的酶活力为100%，30 min 后空白组的相对酶活力则为79.60%；所有离子组的相对酶活力在15 min 和30 min后均高于空白组，对脂肪酶活力稳定性有不同程度的提升，且提升效果随着离子浓度的升高而增强；离子组中，当离子浓度与饮品中离子浓度相同时，浓度为8.83 mmol/L 的Mg2+离子对脂肪酶活力稳定性的维持效果最好，15 min 后相对酶活力为129.95%，30 min后的相对酶活力为114.29%，为空白组30 min 后的相对酶活力的1.44 倍；海水功能饮品组15 min 和30 min后的相对酶活力分别为149.19%、139.18%，远高于单一离子的相对酶活力。

2.3 对脂肪酶影响的机理研究

2.3.1 对脂肪酶Zeta 电位的影响

不同浓度的5 种离子和海水功能饮品对脂肪酶Zeta 电位的影响如图2 所示。

图2 海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶Zeta 电位的影响Fig.2 Effect of marine functional drinks and its five ions on zeta potential of lipase

由图2 可知，伴随着离子浓度的上升，一价离子（Na+、K+）和B3+增加了Zeta 电位绝对值，二价阳离子（Mg2+、Ca2+）降低了Zeta 电位绝对值。海水功能饮品组的Zeta 电位绝对值为12.18 mV，相比空白组绝对值增加了0.68 mV。Zeta 电位绝对值增加，使分子表面静电作用增强，粒子之间的排斥力增加[17]，酶液体系变得更分散、更稳定，可使酶分子更好更均匀地分散在溶液中，不易聚集沉淀。其中，一价阳离子比二价阳离子能更有效地提高酶分子的Zeta 电位绝对值。由于离子的加入可改变酶分子表面氨基酸残基的带电性，使分子表面所带电荷量改变，导致部分氨基酸序列重排，最终使酶分子构象改变。海水功能饮品及5 种离子使脂肪酶的Zeta 电位发生明显改变，证明了海水功能饮品及5 种离子影响了酶分子构象。

2.3.2 紫外吸收光谱分析

海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶紫外光谱特性的影响如图3 所示。

图3 海水功能饮品及其5 种离子与脂肪酶作用的紫外光谱Fig.3 UV spectra of lipase interacting with marine functional drinks and its five ions

由图3 可知，酶液最大吸收峰在194 nm 处，主要是芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）或者肽键中C—O 基的n-p3跃迁所致[18]。离子浓度越高，酶液的吸光度越大，其中Mg2+离子组吸光度变化最大，酶液吸光度由空白组的2.573 1 增至2.618 9，海水功能饮品组的吸光度为2.678 7，是空白组吸光度的1.041 倍。海水功能饮品及5 种离子通过改变发色基团的微环境极性，使其与助色团相连发生共轭效应，从而影响酶分子的构象[19]，表现为吸光度增加和最大吸收峰位红移3 nm。而当蛋白质在溶液中构象发生转变时会影响脂肪酶的结构与功能，表现为对脂肪酶活力的影响[20]。

2.3.3 荧光发射光谱分析

海水功能饮品及其5 种离子对脂肪酶荧光光谱的影响如图4 所示。

图4 海水功能饮品及其5 种离子与脂肪酶作用的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of lipase interacting with marine functional drinks and its five ions

由图4 可知，经300 nm 激发后，天然酶内源荧光在304 nm 处有最大发射峰，此处所得的发射峰主要是芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）残基作用的结果[21-22]。样品组与空白组的荧光强度相比发生了明显变化，离子浓度的增加致使样品荧光强度先升高后降低，荧光发射峰位基本没有出现位移现象，且峰型无明显变化。这说明发生在5 种离子与脂肪酶之间的作用一定程度上影响了脂肪酶分子的结构[23]，从而表现为荧光强度先升后降的趋势。海水功能饮品组的荧光强度最高，为2 529.865，比空白组升高1 152.861。荧光反映生色团所处微环境的信息[14]，海水功能饮品中多种离子的存在，改变了溶液极性，使蛋白质微环境极性增强，致使蛋白质分子构象改变，荧光强度升高[24]。

3 结论

通过对饮品及其5 种常量离子（Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+）对脂肪酶催化活力、Zeta 电位及光谱特性的影响进行分析，得出如下结论：

（1）5 种离子对脂肪酶的活力及稳定性均有促进作用，且随离子浓度的升高而增强，海水功能饮品对脂肪酶促进效果最显著。

（2）一价阳离子（Na+、K+）和B3+比二价阳离子（Mg2+、Ca2+）能更有效地提高酶分子的Zeta 电位绝对值。海水功能饮品使酶分子的Zeta 电位绝对值增加，证实氨基酸残基带电性发生变化，导致氨基酸序列重排，影响酶分子区域构象，使酶液体系变得更分散，不易沉淀。

（3）5 种离子均使脂肪酶的紫外吸收和荧光强度在一定浓度范围内增大。与空白组相比，海水功能饮品组紫外吸光度是空白组的1.041 倍，最大吸收峰红移3 nm，而荧光强度增大1 152.861，表明海水功能饮品中的5 种离子可能通过影响微环境极性，使其与助色团相连发生共轭效应，从而导致酶分子构象改变，影响脂肪酶的结构与功能，表现为对脂肪酶活力的提升。