蜂蜜中农药残留前处理与检测技术研究进展

舒畅，潘志明，吕珍珍，张娴

德阳市食品药品安全检验检测中心，德阳市食品检验重点实验室（德阳 618000）

蜂蜜是一种天然的甜味物质，其主要成分为果糖和葡萄糖，富含多种维生素、矿物质、氨基酸等，营养均衡，具有很高的食用、药用、保健价值，是天然的滋补食品。因其口感好，食用方便，备受广大人群的喜爱[1]。由于蜜蜂在生长、采集花蜜和花粉等活动过程中不可避免地会接触农药，从而引起蜂蜜中的农药残留污染，给消费者带来健康风险[2]。据调查，全球超过75%的蜂蜜含有至少一种农药的残留[3]。蜂蜜中农药来源主要有2种途径：一是养蜂生产中使用杀螨剂引起的药物残留污染[4]；二是蜜蜂采集被农药污染的花蜜、花粉等迁移至蜂蜜中导致污染[5]。为保障消费者的安全与利益，欧美各国及中国先后制定蜂蜜中农药的最大残留限量标准，但是与欧盟和美国、日本、加拿大等发达国家相比，我国蜂蜜限量标准中限量值和农药种类还是个位数，农药残留限量标准也还未成体系[6]。

针对蜂蜜农药残留现行国家标准、前处理方法及检测技术进行分析，以期为健全蜂蜜标准体系、为监管部门、产业界及研究者提供借鉴和参考。

1 我国蜂蜜农药残留标准现状

我国现行的GB 14963——2011《食品安全国家标准蜂蜜》是专门适用于蜂蜜的一项强制执行国标，其中对农药残留限量的要求是“应符合 GB 2763及相关规定”，但是GB 2763——2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对蜂蜜中农药残留并无限量要求。目前我国现行的对蜂蜜中农药残留限量有要求的标准仅有两部：NY/T 1243——2006《蜂蜜中农药残留限量（一）》及GB 31650——2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，限量指标仅有四项。NY/T 1243——2006是2007年2月1日实施的一部行业标准，其中规定了氟胺氰菊酯、氟氯苯氰菊酯和溴螨酯3种杀螨剂的限量，限量值分别为0.05，0.01和0.1 mg/kg。2020年4月1日实施的GB 31650——2019替代了农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》相关部分，删除了蝇毒磷的限量标准，仅对氟胺氰菊酯和双甲脒及其代谢物有限量要求，限量值分别为0.05和0.2 mg/kg。而且两部标准中氟胺氰菊酯项目及限量值重复，四项限量指标完全不能满足当下的市场需求。

1993年6月4日我国进出口商品检验局发布了第一部蜂蜜中农药残留检验标准SN/T 0213.1——1993《出口蜂蜜中杀虫脒残留量检验方法 气相色谱法》。从1993年起蜂蜜中农药残留测定方法标准不断更新，发展至今一共有二十二部，现行有效的共十一部（见表1）。

表1 现行有效蜂蜜中农药残留检验标准

从最初的一种检测项目到如今的近五百种检测项目，从早期的气相色谱法，到如今的液相色谱法、液相色谱-质谱联用法及气相色谱-质谱联用法。但是，大部分标准发布日期较早，而且存在不同程度的缺陷，比如GB/T 21169——2007《蜂蜜中双甲脒及其代谢物残留量测定 液相色谱法》等采用液液萃取方法之后直接上仪器测定，此方法操作简便，但是蜂蜜基质复杂，如果不净化会出现基线高，杂质峰多等情况，影响准确度和精密度。又如农业部781号公告-7-2006 《蜂蜜中氟氯苯氰菊酯残留量的测定 气相色谱法》中利用HLB小柱净化了样品，然而缺乏对基质效应的考虑，可能会出现回收率不理想的情况。再如GB 23200.7——2016 《食品安全国家标准 蜂蜜、果汁和果酒中497种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》中样品经丙酮、二氯甲烷提取后采用多种固相萃取小柱洗脱，净化效果好且考虑了基质效应，但该方法有机试剂用量较大，净化过程消耗时间长，财务成本较高。因此还需开发更经济、更环保、更便捷的前处理方法。

2 蜂蜜中农药残留检测前处理方法

2.1 液液萃取法

液液萃取（LLE）是根据物质在2种不相溶的或微溶的溶剂中的溶解度的不同，使得目标物从一种溶剂转移到另一种溶剂中。随着液液萃取技术的发展，液液萃取技术的类型也在越来越多，如盐析辅助液液萃取（SHLLE）、分散液液微萃取技术（DLLME）等。DLLME是一种操作简单、快速、富集效率高且有机溶剂用量少的环境友好型前处理方法。

方英立等[7]采用液液萃取技术，用4%硫酸钠溶解蜂蜜，乙酸乙酯为提取液，进行蜂蜜中六六六和滴滴涕的测定，回收率为85.5%~113.1%。梁宇等[8]采用液液萃取技术，用1%乙酸水溶解蜂蜜，再用乙酸乙酯萃取，测定蜂蜜中氯虫苯甲酰胺残留量，回收率为90.5%~105.9%。

吕冰等[9]用乙腈基于盐析辅助液液萃取（LLE）交联聚维酮（PVPP）净化技术检测分析蜂蜜中噻虫胺、啶虫脒、烯啶虫胺、呋虫胺、吡虫啉、噻虫嗪和噻虫啉7种新烟碱类农药，7种组分平均回收率为84.8%~112.7%。并且采用已建立的方法对市售的66份蜂蜜样品进行检测，啶虫脒检出15份，含量为0.20~13.44 μg/kg，吡虫啉检出25份，含量为0.10~4.83 μg/kg，噻虫啉检出2份，含量分别为0.14和0.18 μg/kg，噻虫嗪检出1份，含量为0.50 μg/kg。

王东等[10]使用乙腈为分散剂，三氯甲烷为提取剂，通过涡旋、离心使分析物富集到微量三氯甲烷中，采用气相色谱-质谱快速检测蜂蜜中六六六（BHC）和滴滴涕（DDT）类农药残留。回收率为61.0%~100.1%，最低检测浓度均为20 μg/kg。

2.2 固相萃取法

固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）是液固萃取和柱液相色谱结合的一种前处理方法，具有操作简单、使用溶剂少、净化效果好等优点，缺点是需要专门的固相萃取装置。目前在蜂蜜农药残留测定中常使用的SPE柱有HLB柱、氟罗里矽柱、氨基柱、PSA、C18吸附剂以及人工填充的SPE柱。

汪建妹等[11]将蜂蜜经乙腈-水（8︰2）提取，用PRiME HLB柱净化，超高相液相色谱-串联质谱分析39种抗生素和25种农药，农药回收率在72%~115%。陈兴莲等[12]将蜂蜜样品溶于纯净水中，加入氯化钠和乙腈提取，使用添加PSA的氟罗里矽柱净化，结果显示六六六和滴滴涕平均回收率为70.2%~97.4%。

何丽君等[13]用15%氯化钠水溶液溶解蜂蜜后，以1%甲酸乙腈进行盐析提取，并考察分散固相萃取法（DSPE）净化填料PSA和C18粉末的用量，结果表明使用50 mg PSA和25 mg C18粉末可获得较优的净化效果，回收率为73.9%~110.4%。张烁等[14]以10%氯化钠溶液溶解蜂蜜，1%甲酸乙腈为萃取溶液，比较HLB固相萃取法和以50 mg PSA和50 mg C18为吸附剂的分散固相萃取法。结果发现DSPE和HLB柱2种净化方法均无明显的基质增强或抑制效应，但HLB柱洗脱较慢，繁琐耗时。在加标回收试验中，HLB柱法对毒死蜱的绝对回收率低于50%，而DSPE法对14种农药的绝对回收率在80.3%~112.7%，故试验采用DSPE法。

杨青等[15]采用乙酸乙酯为萃取溶剂，乙酸乙酯-正己烷（1︰1）为洗脱剂，利用自制的硅胶固定化聚硅氧烷离子液体材料填充萃取柱，运用气相色谱ECD检测器测定蜂蜜中6种有机氯农药残留，相关系数（r）均大于0.999，回收率在76.4%~104.0%，SRSD在3.52%~11.38%。He等[16]以马拉硫磷为模板，甲基丙烯酸缩水甘油酯为亲水共聚单体，首次制备新型分子印迹聚合物，并作为固相萃取柱内的吸附剂，对马拉硫磷、环磷辛烷、甲拌磷、叔丁磷、乐果和芬胺磷6种农药进行萃取，结果表明：其萃取能力与商用萃取柱相当，将该柱与气相色谱法联用检测蜂蜜中农药残留，方法线性范围为0.01~1.0 μg/mL，检出限为0.000 5~0.001 9 g/mL，SRSD为2.26%~4.81%，相对回收率为90.9%~97.6%。

2.3 QuEChERS法

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）法是在固相萃取法基础上发展起来由美国化学家Steven J.Lehotay和德国Michelangeio Anastassiadas提出的，具有快速、简便、廉价、高效、耐用和可靠等特点，同时所需溶剂需要量少、污染低[17]。QuEChERS法采用的净化剂主要有PSA粉末、C18粉末和石墨化碳黑（graphitizedcarbon black，GCB）粉末3种。蜂蜜主要的干扰物质来自于糖类、有机酸，PSA可有效去除样品基质中的糖类、脂肪酸、酚类、有机酸等干扰物质及部分极性色素[18-19]。

刘建辉等[20]称取蜂蜜样品用超纯水浸泡溶解，加乙腈和氯化钠提取，旋蒸浓缩后再次使用乙腈复溶，加入QuEChERS分散式固相萃取试剂盒（50 mg C18、50 mg PSA、7.5 mg GCB、150 mg MgSO4），测得氟胺氰菊酯回收率为92.00%~93.40%。李燕妹[21]用水充分溶解蜂蜜样品，加入氯化钠和乙酸乙酯提取，对比Carb/PSA固相萃取柱和QuEChERS法（只含PSA粉末），结果显示2种净化方法效果差别不大，15种农药回收均落在80%~110%之间，但考虑到QuEChERS法方便快捷、价格低廉、适用面广，故采用QuEChERS法净化蜂蜜样品。樊艳等[22]采用不同的QuEChERS提取盐包（a为4 g硫酸镁、1 g乙酸钠；b为4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g三水合二柠檬酸二钠；c为4 g硫酸镁、1 g氯化钠）和不同净化剂（a为硫酸镁、PSA、C18；ab为硫酸镁、石墨化碳黑、PSA、C18）对溶解后的蜂蜜进行提取、净化，经盐包b提取后伏杀硫磷回收率超过120%，盐包c提取后氧乐果、乐果、甲基毒死蜱回收率低于80%，样品经净化剂b净化后甲基毒死蜱、毒死蜱回收率低于70%，分析原因是石墨化碳黑对非极性农药具有较强的吸附性，使其不易被洗脱，故试验采用提取盐包a（4 g硫酸镁、1 g乙酸钠）和净化剂a（硫酸镁、PSA、C18）。

3 蜂蜜中农药残留检测技术

3.1 色谱法

3.1.1 气相色谱

气相色谱法具有样品用量少、灵敏度高、准确度高、分离性能好等特点，应用范围广泛。气相色谱法的缺点是汽化过程中某些不稳定的农药产生热降解，影响分析结果，因而不适用强极性化合物的测定。隋吴彬[23]运用气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）测定蜂蜜中滴滴涕、甲胺磷、甲拌磷等8种有机磷农药残留物。检测限为0.021~0.100 μg/mL，平均回收率在81%~100%之间。李欢欢等[24]采用气相色谱-电子捕获器（GC-ECD）分析检测襄阳产地蜂蜜中六六六和滴滴涕，检出限为0.028~0.090 μg/kg，回收率为60.37%~115.98%，并且在蜂蜜样品中有3种有机氯农药残留检出，分别是α-666、β-666和γ-666，含量为0.27~0.80 μg/kg。

3.1.2 液相色谱

液相色谱法与气相色谱法相比，灵敏度高，适用于沸点较高、分子量大、热稳定性较差的有机化合物检测，但是液相色谱法因溶剂使用量大、分离度不够等问题，应用范围受到部分限制[25]。于玲[26]采用超声辅助分散液液微萃取技术结合高效液相色谱法测定蜂蜜中的溴氰菊酯，溴氰菊酯在10~1 000 μg/kg范围内线性良好，加标回收率为82.6%~97.3%。蜂蜜样品中溴氰菊酯的检出限为8 μg/kg。该方法具有效率高、测试成本低及有机溶剂消耗量少等明显优势，开辟对复杂基质如蜂蜜中溴氰菊酯含量测定的新方法。

3.1.3 薄层色谱

薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）是1950年由科学家Kirchner等根据被分离物质在固定相和流动相中吸附的差异性来实现目标物的分离提出的一种简便的分析方法[27]。梁睿等[28]采用高效薄层色谱（HPTLC）法测定蜂蜜中吡虫啉、噻虫胺和噻虫嗪3种新烟碱类杀虫剂。3种农药在蜂蜜中添加回收率为71.58%~109.47%，相对标准偏差为7.79%~14.23%，均满足农残分析的基本要求。

3.2 联用技术

3.2.1 气质联用

气相色谱-质谱联用具有气相色谱高分离度和质谱高准确度、高灵敏度的特点，克服气相色谱可能出现的假阴性或假阳性情况。在农药多残留分析中得到广泛应用，可同时分析几百种易挥发热稳定强的农药。郑剑锋等[29]采用HP-5MS色谱柱实现12 min内完成蜂蜜中112种农药分析，112种农药组分的检出限为0.002 mg/kg，回收率在68.4%~102%之间。该方法具有操作简单、快速、灵敏、准确等特点。张晶等[30]采用DB-5MS色谱柱同时测定蜂蜜中双甲脒、2, 4-二甲基苯胺和氟胺氰菊酯的浓度，3种化合物的最低检出浓度均为0.01 mg/kg，回收率为83.62%~109.75%。

3.2.2 液质联用

液相色谱-质谱联用技术专属性强、灵敏度高、检出限低、分析效率高。朱之烔等[31]建立同时测定蜂蜜中9种苯并咪唑类和新烟碱类农药的全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱检测方法。9种农药的检出限和定量限分别为0.1~1.0 μg/kg，平均回收率在78.2%~101.2%之间。用该方法对实际30批蜂蜜样品进行检测，多菌灵、吡虫啉和啶虫脒分别有不同程度检出。其中多菌灵检出17批，残留量在5~10 μg/kg之间。吡虫啉和啶虫脒分别检出13批和12批，检出量分别为5~20 μg/kg和5~10 μg/kg。王思威等[32]利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱结合QuEChERS前处理技术，建立蜂蜜中未知农药残留的非靶向快速筛查方法。结果共筛选出嘧菌酯、吡唑醚菌酯及其代谢物、苯醚甲环唑、多菌灵、毒死蜱、除虫脲和灭幼脲8种农药，在1~1 000 μg/L范围内线性关系良好，方法检出限为0.03~0.50 μg/kg，8种农药在蜂蜜中平均加标回收率为81%~96%。并在实际样品中吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、除虫脲检出量分别为0.3~4.8，0.1~1.0和2.3 μg/kg。Wang等[33]采用QuEChERS前处理技术结合气相色谱-质谱联用技术和液相色谱-质谱联用技术，检测我国六盘山周边的72个蜂巢及蜂蜜，其中蜂蜜中检出氯虫苯甲酰胺和噻虫嗪。

3.3 其他方法

荧光光谱具有水分干扰小、灵敏度高、操作简便等优点。葛学峰等[34]利用稳态荧光光谱仪对蜂蜜溶液中腐霉利的含量进行了检测和研究。结果表明，腐霉利用溶液在390 nm处有较强的荧光峰，并且腐霉利含量与荧光强度具有良好的线性关系，说明可以使用荧光光谱法判定纯蜂蜜中是否有腐霉利农药残留。

近年来发展的可视化蛋白芯片的检测方法，可同时检测多种药物及有害物残留。与传统蛋白芯片法相比，具有可视化、直接用肉眼观察芯片结果，大幅降低检测成本，提高检测效率，在农药残留的现场快速检测中有很好的发展前景。孟东等[35]建立可视化微阵列蛋白芯片法同时检测蜂蜜中多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷3种农药残留含量的分析方法。该方法对多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷的定量检测范围分别为0.4~6.4，0.3~4.8和0.75~12 ng/mL，检测限分别为3.21，2.47和2.52 ng/mL，准确度为83.6%~126.4%。

4 结语

随着蜂蜜中农药残留检测技术的完善与更新，前处理方法逐步向方便快捷、经济安全、高净化、低污染的方向发展。检测设备从单一的色谱法到多种手段联用的方法提升，有效提高灵敏度、准确度和精密度。

我国是蜂蜜大国，断然不可因为不够完善的标准体系影响国内蜂蜜行业的发展及国际进出口贸易。农药残留是蜂蜜产业发展面临的一项重要安全问题。研究蜂蜜中农药残留前处理和检测技术，对于评估蜂蜜风险、健全标准体系、保障人民健康、监管蜂蜜产业、促进贸易发展等都具有极其重要的意义。